金絲楸幼苗響應鹽堿脅迫的生理和轉錄組分析

郜新強　王小艷　焦偉等

關鍵詞：金絲楸；鹽堿脅迫；轉錄組；差異表達基因；耐鹽堿機制

中圖分類號：S722 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1498（2023）01-0166-13

當前，全球土地鹽堿化是人類面臨的主要生態危機之一，給農業生產帶來了巨大損失，嚴重威脅人類生存。據不完全統計，全球鹽堿地面積約為9.54×10⁹hm²，約占可耕地面積的10%，而我國鹽堿地面積約有9.87×10⁸hm²，位居世界第三，大部分為土壤鹽化和堿化同時存在的復合鹽堿地。目前，科學合理地開發和利用鹽堿地已經成為我國農業和林業發展過程中面臨的嚴峻挑戰。

楸樹（Catalpa bungei C.A.Mey.）是我國特有的珍貴優質用材和園林觀賞樹種，屬于紫葳科（Bignoniaceae）梓屬（Catalpa）落葉喬木，其材質好、用途廣、經濟價值高，自古就有“木王”的美譽。金絲楸自然分布于河南、山東和安徽等省，是楸樹的一個地理變種，具有特殊金色紋理、生長快和干型通直的優點，近年來得到大面積推廣。目前，楸樹的研究主要集中在嫁接繁育、組培快繁、扦插繁殖、遺傳轉化、遺傳多樣性分析等方面，關于楸樹耐鹽堿的研究鮮有報道。認識和了解楸樹耐鹽堿機制，對指導楸樹抗鹽堿遺傳改良和利用鹽堿地具有重要的理論價值和現實意義。

近年來，轉錄組測序技術（RNA-Seq）發展迅速，該技術無須了解物種基因組信息，彌補了非模式植物轉錄組研究中缺乏基因組信息的不足。利用轉錄組解析植物的抗逆機制已經成為逆境研究的熱點之一。目前，利用RNA-Seq已進行了大麥、水稻、高粱等鹽脅迫的轉錄組分析，對這些植物響應鹽脅迫機理的探討，加深了人們對植物耐鹽機制的認識。但是，通過轉錄組分析楸樹耐鹽堿分子機制的研究尚未見報道，僅有通過轉錄組分析楸樹雄性不育和不定根發育分子機制的極少數報道。

本研究以金絲楸幼苗為試驗材料，分析不同鹽堿脅迫對金絲楸生長情況、光合及生理特性的影響，探究其耐鹽堿生理機制。進一步利用RNA-Seq，對處理組和對照組進行DEGs分析，在轉錄水平上對楸樹耐鹽堿機制進行探索，以期為楸樹應答鹽堿脅迫的分子機制研究提供理論參考，同時也為重要基因的克隆及其功能研究等奠定基礎。

1研究方法

1.1試驗材料和設計

試驗于安陽工學院溫室中進行，2020年6月，選擇生長健壯、形態一致、根系完整的金絲楸幼苗種子盆中，每盆種3株，共種40盆。正常栽培管理，60 d后進行鹽堿脅迫處理。分別設置中性鹽A（NaCl）、堿性鹽B（Na₂CO₃）、混合鹽堿C（NaCl：Na₂CO₃=1：1）3種鹽堿脅迫處理，總鹽濃度設置50、100、150、200 mmol·L^-14個梯度，A1-A4、B1-B4、C1-C4分別代表從低到高的NaCl、Na2CO3、混合鹽堿脅迫的4個濃度，共12個處理濃度。2020年8月，將試驗材料隨機分成13組，每組3盆，每盆澆2.0 L相應濃度的處理液，對照組澆等體積的清水。期間正常栽培管理，脅迫30 d后進行生長、光合及生理指標的測定。脅迫7d后取長勢一致且大小相近的4組（CK、A2、B2和C2）葉片用于轉錄組測序，生物學重復2次。

1.2鹽堿脅迫危害調查

各處理組在鹽堿脅迫后定期（14、21、28d）對植株和葉片進行危害調查，根據脅迫傷害癥狀，設置分級標準（圖1）如下：

0級：枝條和葉片未見鹽堿脅迫危害癥狀；

1級：有極少部分葉尖、葉緣和葉脈變黃，枝條外觀正常；

2級：有少部分的葉尖、葉緣焦枯，枝條外觀正常；

3級：約有1/4葉片有葉尖、葉緣焦枯和落葉現象；

4級：約有1/2葉片枝枯、葉落直至死亡。

1.3生長、光合及生理測定

1.3.1新增株高和地徑測定 對照組和處理組均選擇3株進行編號，處理前用卷尺和游標卡尺測定株高和地徑，脅迫30d后，再次測定上述指標，計算凈生長量。

1.3.2生物量測定 脅迫30 d后，取對照組和處理組編號植株的根和地上部稱其鮮質量，80℃烘干至恒質量，稱其干質量，計算生物量（根干質量+地上部干質量）、根冠比（根干質量／地上部于質量）及生長脅迫指數（處理組植株干質量，對照組植株干質量）。

1.3.3光合指標測定

用SPAD-502Plus葉綠素儀測定葉綠素總量，EBA-PE1001高光效儀測定光合速率。

1.3.4生理生化指標測定 用電導儀法測定相對電導率，用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，用氮藍四唑法測定SOD酶活，用蒽酮顯色法測定可溶性糖含量，用酸性茚三酮法測定Pro含量。

1.4轉錄組測序和分析

1.4.1轉錄組測序 樣品經過RNA抽提、純化、建庫后，基于Illumina HiSeq測序平臺進行雙末端測序。

1.4.2測序讀長分析及拼接對原始數據進行過濾，將帶接頭、小于50 bp、平均質量在Q20以下的Reads去除，得到高質量序列（CleanReads），使用Trinity對Clean Reads進行De novo拼接得到轉錄本序列，挑選最長的轉錄本作為Unigene。

1.4.3 Unigenes功能注釋、分類、代謝途徑分析以及表達量計算 用Blast對Unigenes進行NR、GO、KEGG、eggNOG、SwissProt和Pfam注釋；對所有Unigenes進行GO功能分析和KEGG代謝途徑分析。用轉錄組表達定量軟件RSEM，計算每個基因的FPKM值，來代表每個基因的表達水平。

1.4.4差異表達基因分析 用DESeq對基因表達進行差異分析，篩選DEGs條件為：表達差異倍數｜log₂FoldChange｜>1，顯著性P-value<0.05。然后將得到的DEGs再進行GO和KEGG分析。

1.4.5轉錄因子分析 將蛋白質序列與Plant TFDB數據庫比較，分析得到轉錄因子及其所屬家族信息。

2結果與分析

2.1不同鹽堿脅迫對金絲楸生長的影響

不同鹽堿脅迫后，金絲楸均出現鹽堿脅迫危害癥狀。Na₂CO₃脅迫對葉片傷害較大，隨脅迫濃度和時間的增加，傷害等級增大，脅迫處理14 d，150 mmol·L^-1時傷害等級達到3級，而200mmol·L^-1時達到4級；而NaCl脅迫對葉片傷害較小，脅迫處理21 d，150 mmol·L^-1時傷害等級達到2級，200 mmol·L^-1時達到4級；混合鹽堿脅迫下葉片傷害介于Na₂CO₃和NaCl之間。

不同鹽堿脅迫下，金絲楸的生長情況受到不同程度的影響（表1）。NaCl脅迫下，50mmol·L^-1時新增株高被極顯著的抑制，且濃度越高抑制作用越顯著；Na₂CO₃脅迫對新增株高的影響較小，在50 mmol·L^-1時新增株高顯著降低，且隨濃度增加株高極顯著降低；混合鹽堿脅迫對新增株高抑制作用最輕，但也都達到極顯著水平。此外，低濃度NaCl和Na₂CO₃脅迫對地徑有增粗作用，在50mmol·L^-1NaCl脅迫下，新增地徑顯著增加，而在150、200 mmol·L^-1不同鹽堿脅迫下，新增地徑均極顯著減小。

植物在鹽堿脅迫下生物量的變化可直觀反映生長狀況（表1）。與對照組相比，NaCl和混合鹽堿處理組，50 mmol·L^-1時地上部干質量和鮮質量都有增加，但隨濃度增加而下降；Na₂CO₃處理組地上部干質量和鮮質量隨著濃度增加而下降。根干質量和鮮質量只在50 mmol·L^-1混合鹽堿處理組有增加，其它處理組都隨濃度增加而下降。生物量的變化趨勢與地上部干質量的變化基本一致。各處理組的根冠比均顯著降低。不同鹽堿脅迫下生長脅迫指數均隨脅迫濃度的增加而降低，200 mmol·L^-1時各處理組生長脅迫指數分別為0.26、0.18、0.23，可以看出Na₂CO₃脅迫降幅較大，NaCl和混合鹽堿脅迫對生長脅迫指數影響較小。這些結果表明，Na₂CO₃和混合鹽堿脅迫對金絲楸的生長發育抑制更嚴重，與對葉片危害的影響一致。

2.2不同鹽堿脅迫對金絲楸生理和光合指標的影響

不同鹽堿脅迫對金絲楸生理和光合指標的影響見表2。各處理組中，MDA含量和相對電導率都隨處理濃度的增加而顯著上升。NaCl和混合鹽堿處理組中，可溶性糖含量在50～150 mmol·L^-1時逐漸積累，而在200 mmol·L^-1時小幅下降；而Na₂CO₃處理組中，在100 mmol·L^-1時達到最大值，隨濃度增加而下降。各處理組中，Pro含量都明顯增加，均在100 mmol·L^-1時達到最大值，之后隨處理濃度的增加而逐漸下降，但仍明顯高于對照組。各處理組中，SOD活性在中低濃度都有所增加，其中，100～150 mmol·L^-1時顯著增加，200 mmol·L^-1時下降。各處理組中，低濃度時葉綠素總量和光合速率增加，都在100 mmol·L^-1時達到最大值，之后隨處理濃度的增加而逐漸下降。

2.3轉錄組測序、組裝和分析

對試驗中的8個樣品測序后分別獲得了約50 000 000條原始序列，共測得約60.4 Gb原始數據。過濾后Clean datas約占原始序列數據的93%；堿基數約占原始堿基數的93%；Q20和Q30值分別在97%和93%以上。混合2個樣品的Clean datas，用Trinity軟件進行De novo組裝，共得到171339個Transcripts， 55793個Unigeneso Transcript和Unigene序列平均長度分別為1768.34 bp和1275.65 bp，

N50分別為2597 bp和2263 bp， GC含量分別為39.59%和38.72%。

2.4注釋結果分析

對55 793個Unigenes進行基因功能注釋，在NR、GO、KEGG、Pfam、eggNOG和Swiss-Prot數據庫中分別注釋28 722個（51.48%）、13185個（23.63%）、11967個（21.45%）、15837個（28.39%）、27 242個（48.83%）和21694個（38.88%），其中，29534 （52.93%）個Unigenes最少被1個數據庫注釋，5124（9.18%）個Unigenes被6個數據庫注釋。28722個Unigenes在NR數據庫中獲得注釋，其中，5.8% Unigenes與之完全匹配，15.94% Unigenes不完全匹配。相似度在95%～100%、80%～95%、60%～80%、40%～60%和≤40%的Unigenes比例分別為5.98%、32.12%、35.43%、20.45%和6.02%。被注釋到芝麻（Sesamum indicum L.）、地黃猴面花（Erythranthe guttata DC.）、施蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum B.）、葡萄（Vitisvinifera L.）、咖啡（Coffea canephora PF.）、大麥（Hordeum vulgare L.）、可可（Theobroma cacao L.）和其他物種Unigenes比例分別為55.95%、14.67%、3.35%、2.09%、0.97%、0.91%、0.76%和21.31%。

基因GO注釋后，將成功注釋的基因依照GO的三個大類進行分類。Unigenes富集最多的是代謝過程和細胞過程、細胞膜和細胞、結合和催化活性。KEGG代謝通路上，基因注釋最多的分別為碳水化合物代謝、翻譯、信號分解代謝、運輸分解代謝和內分泌系統。eggNOG比對注釋，基因注釋最多目錄分別為功能未知、僅通用功能預測、信號傳導機制和翻譯后修飾、蛋白質周轉、伴侶。

2.5差異表達基因分析

為進一步了解楸樹對不同鹽堿脅迫反應的轉錄組特征，分析比較了對照組和3種處理組的DEGs。對照組與NaCl處理組（A vs C）產生1779個DEGs（上調844個，下調935個），對照組與Na₂CO₃處理組（A vs D）產生2835個DEGs（上調1326個，下調1509個），對照組與混合鹽堿處理組（A vs E）產生4059個DEGs（上調2295個，下調1764個），說明這些DEGs與不同鹽堿脅迫應答密切相關。根據差異分析的結果，維恩圖進一步展示了各比較組間特異DEGs的個數以及比較組間的重疊關系。A vsC與Avs D之間有1 036個共有DEGs，A vsD與Avs E之間有1530個共有DEGs，A vsC與Avs E之間有963個共有DEGs，3個比較組之間有717個共有DEGs。Avs C有497個特異DEGs，Avs D有986個特異DEGs，A vsE有2 283個特異DEGs（圖2）。說明共有DEGs可能由不同的鹽堿脅迫共同引起的，特異DEGs可能響應不同的鹽堿脅迫反應。

2.6差異表達基因富集分析

對DEGs進一步GO富集分析發現，在細胞組分、分子功能和生物過程方面存在差異。在細胞組分方面，膜的整體成分、膜的內在成分、膜等在不同鹽堿脅迫下被顯著富集。在分子功能方面，催化活性、氧化還原酶活性、信號傳感器活性、單加氧酶活性、水解酶活性、水解o-糖基化合物等在不同鹽堿脅迫下被顯著富集。在生物過程方面，類異戊二烯代謝和生物合成過程、防衛反應、碳水化合物代謝過程等在不同鹽堿脅迫下被顯著富集（圖3～5）。

通過對DEGs進一步KEGG分析發現，DEGs主要集中在代謝途徑。NaCl脅迫下顯著富集的通路為：萜類主干生物合成、苯丙素的生物合成、植物激素信號轉導、光合生物中的碳固定（圖6）；Na₂CO₃脅迫下顯著富集的通路為：淀粉和蔗糖代謝、苯丙素的生物合成、氰氨基酸代謝、精氨酸生物合成（圖7）；混合鹽堿脅迫下顯著富集的通路為：淀粉和蔗糖代謝、萜類主干生物合成、苯丙素的生物合成、植物激素信號轉導（圖8）。

2.7轉錄因子分析

植物轉錄因子廣泛參與多種生物過程，并在轉錄水平上調控基因的表達，是許多逆境脅迫響應基因的重要調控因子，在植物對逆境脅迫的應答過程中發揮重要作用。為了進一步研究楸樹中可能參與鹽堿脅迫的轉錄因子，筆者共鑒定出6725個差異表達轉錄因子，分屬于57個不同的轉錄因子家族，其中，bHLH、ERF、MYB-related、NAC、C2H2、WRKY、MYB和bZIP轉錄因子家族成員最多。

3討論

3.1不同鹽堿脅迫對金絲楸生長的影響

鹽堿脅迫對植物最直接的影響就是抑制其正常的生長發育。本研究發現，Na₂CO₃脅迫對金絲楸葉片傷害程度最大，NaCl最小，與前人研究結果一致。不同鹽堿脅迫導致了金絲楸新增株高和地徑、生物量、根冠比不同程度的降低，并且隨著脅迫濃度的增加而加強（表1），表明其對不同鹽堿脅迫的忍耐能力存在差異，這與其它植物中的研究結果相同。分析對新增株高的影響程度依次為NaCl>Na₂CO₃>混合鹽堿，3種脅迫的中高濃度都極顯著抑制新增地徑的增長（表1）。對地上部和根的干質量以及生物量積累的影響程度依次為Na₂CO₃>NaCl>混合鹽堿，但50 mmol·L^-1時NaCl和Na2C03脅迫對地徑有增粗作用，其中NaCl脅迫顯著增加，50 mmol·L^-1時混合鹽堿脅迫對地上部和根的干質量和鮮質量均顯著或極顯著增加（表1），其它植物的研究也得到類似結果。

3.2不同鹽堿脅迫對金絲楸生理代謝和光合作用的影響

鹽堿脅迫還會影響植物的生理代謝和光合作用。MDA是植物體內膜脂過氧化的產物，常作為對逆境反應強弱的指標。本研究發現，不同鹽堿脅迫后MDA都不同程度增加，其中，在中高濃度脅迫后顯著增加（表2），該結果與前人研究結果一致。Pro能調節滲透勢和改善細胞內環境，可溶性糖能維持細胞滲透勢和提供碳源，它們是植物通過滲透調節作用對逆境脅迫的一種生理響應。本研究發現，不同鹽堿脅迫后，Pro和可溶性糖含量都顯著上升，在100或150 mmol·L^-1時達到最大值，濃度繼續升高后會小幅降低，但仍高于對照組（表2），這一結果與之前關于鹽堿脅迫對Pro和可溶性糖含量影響的研究結果相吻合。說明在一定濃度范圍內楸樹可以通過增加體內Pro和可溶性糖的含量，降低細胞滲透勢，超過這個范圍，Pro和可溶性糖合成受到抑制。鹽堿脅迫會使植物產生大量的活性氧自由基，破壞細胞膜系統，抗氧化酶活性的升高可增強自由基清除能力，減輕傷害。本研究發現，不同鹽堿脅迫下SOD都隨濃度增加呈先升后降的趨勢（表2），這與孫海菁等之前發現的情況一致。說明當鹽堿脅迫超出閾值后，過量的自由基對植物造成損傷，SOD活性降低。葉綠素是植物光合作用的物質基礎，是反映光合能力的重要指標。本研究發現，在低濃度鹽堿脅迫下葉綠素總量升高，光合速率顯著提高（表2），說明低濃度脅迫能夠促進葉綠素的合成和光合作用，而在高濃度脅迫下葉綠素總量和光合速率下降。該結果和地上部生物量的結果基本一致，但與前人的研究結果不完全一致，可能與物種差異有關，有待進一步研究。

3.3差異表達基因分析

RNA-Seq是研究植物非生物脅迫分子機制的良好手段，楸樹作為非模式植物，缺乏基因組背景，RNA-Seq為從轉錄水平研究楸樹耐鹽堿分子機制、基因挖掘及相關代謝通路的發現提供了可能。本研究分別對NaCl、Na₂CO₃和混合鹽堿處理組及對照組進行轉錄組測序及分析。DEGsGO富集結果表明，在細胞組分方面，膜的整體成分、內在成分和膜在不同鹽堿脅迫下均顯著富集，說明膜及其成分在不同鹽堿脅迫下都發揮積極作用。在分子功能方面，富集結果相差較大，催化活性和氧化還原酶活性主要響應NaCl脅迫；信號傳感器活性和單加氧酶活性主要響應Na₂CO₃脅迫；催化活性和水解o-糖基化合物主要響應混合鹽堿脅迫，說明不同分子功能響應不同的鹽堿脅迫。在生物過程方面，類異戊二烯代謝和生物合成過程在不同鹽堿脅迫下都顯著富集，說明類異戊二烯對植物耐鹽堿非常重要；二甲基烯丙基二磷酸生物合成過程、防衛反應和碳水化合物代謝過程分別單獨顯著富集（圖3～5）。DEGs KEGG分析結果表明，苯丙素生物合成在不同鹽堿脅迫中均顯著富集，植物激素信號轉導和萜類主干生物合成在NaCl和混合鹽堿脅迫中都顯著富集，淀粉和蔗糖代謝在Na₂CO₃和混合鹽堿脅迫中都顯著富集，還有光合生物碳固定、精氨酸代謝和生物合成分別在NaCl、Na₂CO₃脅迫中單獨顯著富集（圖6～8）。說明苯丙素生物合成、植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖代謝、萜類主干生物合成、類異戊二烯通路在應答鹽堿脅迫時至關重要，與前人轉錄組測序分析結果一致。以上結果暗示這些功能與途徑可能在楸樹響應不同鹽堿脅迫中起著重要作用，這些注釋信息也為進一步挖掘楸樹抗不同鹽堿基因提供了數據資源。

3.4轉錄因子分析

轉錄因子在植物對多種逆境脅迫的應答過程中發揮重要作用。目前，已報道的響應鹽堿脅迫的轉錄因子有WRKY、NAC、bZIP、MYB、bHLH等家族成員。WRKY是一類鋅指蛋白家族，對植物抗逆有著重要作用。玉米ZmWRKY33、高粱SbWRKY50和花生AhWRKY75等WRKY轉錄因子對耐鹽性起作用。NAC是植物特有的轉錄因子家族，在植物發育、逆境應答等過程中發揮多重作用。水稻ONAC022、小麥TaNAC67和大豆GmSIN1等NAC轉錄因子與耐鹽能力有關。bZIP轉錄因子參與依賴ABA信號的途徑，調控相關抗鹽堿基因的表達。棉花GhABF2、玉米ABP9和大豆GmbZIP2等bZIP轉錄因子控制鹽堿耐性。MYB轉錄因子廣泛參與植物的生長發育、逆境響應和激素信號轉導。擬南芥MYB111、大豆GmMYB12和菠蘿AcoMYB4等MYB轉錄因子調控鹽脅迫響應基因。bHLH轉錄因子同樣在非生物脅迫應答中起著重要作用。小麥TabHLH1、水稻OsbHLH035和楊梅MfbHLH38等bHLH轉錄因子應答鹽脅迫反應。本研究鑒定出bHLH、ERF、MYB-related、NAC、C2H2、WRKY、MYB和bZIP轉錄因子家族成員最多，這些轉錄因子與不同鹽堿耐性相關，說明楸樹耐鹽堿機制是由多種轉錄因子共同調控的。

4結論

本研究通過對不同鹽堿脅迫下金絲楸幼苗生長情況、生理指標和光合特性進行測定及分析，新增株高和地徑、生物量、根冠比等都明顯受到抑制，生長情況受抑制程度為Na₂CO₃>混合鹽堿>NaCl。金絲楸幼苗主要通過積累滲透調節物質、提高抗氧化酶系統和光合作用來共同抵御鹽堿脅迫，但都呈現“低促高抑”的現象，具有一定閾值。通過對對照組和3種處理組葉片進行轉錄組測序及分析，3個比較組分別篩選出1779、2835和4059個DEGs。通過DEGs GO功能和KEGG通路分析，理清了DEGs富集的生物過程與代謝通路。金絲楸通過調節膜成分、催化活性、類異戊二烯代謝和生物合成過程、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉導等生物過程和代謝途徑，并結合相關轉錄因子共同響應鹽堿脅迫（圖9）。綜上所述，本研究的首次嘗試為全面解析楸樹耐鹽堿機制研究提供理論參考，同時也為后期重要基因克隆及其功能分析等奠定基礎。