秋茄低溫脅迫轉錄組分析及脫落酸信號途徑基因挖掘

郭晉敏 楊升 劉星 王金旺 王文卿 陳秋夏

關鍵詞：秋茄；低溫脅迫；轉錄組；轉錄因子；脫落酸信號途徑

紅樹林是分布于熱帶亞熱帶沿海潮間帶的特有植物群落。秋茄（Kandelia obovata Sheue，H．Y．Liu&J．Yong）是最耐寒的紅樹植物。它自然分布于越南的北部，中國的海南、香港、廣東、福建、臺灣，日本的南部，人工引種最北到中國浙江省溫州市西門島一帶。低溫是限制秋茄分布的最主要因素。在全球氣候變暖的大背景下，高緯度地區冬季逐漸變暖，這使得冷敏感植物跨出之前的分布范圍向北移動。與此同時，高緯度地區冬季不時發生的極端低溫天氣對北移的冷敏感植物生存造成極大危害，如2008年和2016年中國南方發生的多起極端寒潮事件對當地紅樹林造成了嚴重影響，更有甚者如2016年溫州西門島一帶發生50年一遇的極端低溫寒潮（-5℃左右）對當地引種的秋茄造成了極其嚴重的凍害。因此，秋茄的抗寒研究極其緊迫和重要。

轉錄因子的轉錄調控是植物響應低溫脅迫的關鍵部分，轉錄因子通過識別下游基因啟動子上的功能元件來激活或者抑制目標基因表達，引起植株體內低溫相關代謝途徑產生變化，從而改變植物對于外界低溫脅迫刺激的適應能力。目前，在80多個轉錄因子家族中，只有NAC、MYB、WRKY、bZIP和ERF等少數在非生物脅迫響應中起重要作用的轉錄因子家族被深入研究過。Sharma等研究發現，在低溫脅迫條件下，擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）中有43個家族轉錄因子表達上調，其中，WRKY、NAC、MYB、AP2/ERF和bZIP轉錄因子基因在所有基因集中高度富集，調控了56%冷脅迫下常見的表達基因。在秋茄響應低溫脅迫的相關研究中，Fei等和Su等將bHLH、MYB-related和WRKY等轉錄因子認定為秋茄低溫應激反應中有價值的候選調節因子，而其他轉錄因子在秋茄抗寒的相關研究中鮮有報道。

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一類對植物生長、果實成熟和非生物脅迫響應起至關重要作用的植物激素，自20世紀60年代首次被發現以來，ABA信號通路響應低溫脅迫的相關研究獲得了重大突破。植物遭遇低溫脅迫時，ABA與ABA受體蛋白（pyrabactin resistance/PYR-like/regulatory component of ABA receptor，PYR/PYL/RGAR）結合，形成的復合體會抑制2C型蛋白磷酸酶（type 2C protein phosphatases，PP2Cs）的活性，導致類SNF-1相關蛋白激酶2（class SNF-1-relatedproteinkinase

2，SnRK2/SRK2）的激活和釋放，該蛋白直接磷酸化并積極控制ABF/AREB轉錄因子，最終調控相關抗寒基因的表達。ABA信號途徑響應低溫脅迫已在水稻（Oryza sativaL）、蘋果（Maluspumila Mill.）、花椒（Zanthoxylumbungeanum Maxim）等多種植物中得到證實，而在秋茄抗寒的相關研究中少有報道。

本研究通過高通量測序技術對低溫脅迫下秋茄葉片進行了轉錄組學分析，并對ABA信號途徑中關鍵基因進行挖掘，旨在為深入了解秋茄響應低溫脅迫的分子機制提供了科學參考，為抗寒品種的培育提供了可能。

1材料與方法

1.1材料

以浙江省亞熱帶作物研究所選育的耐寒紅樹植物‘龍港秋茄1年生容器苗為植物材料，挑選生長良好，長勢一致，無病害植株作為供試材料（圖1）。試驗于2020年12月在浙江省農業科學院蔬菜研究所內進行，將供試材料置于人工氣候室（型號：SAFE-DG-ZJNKY-6）中，光照時間為11h.d-1，15℃處理12h為對照組（CK），-5℃處理12h為低溫組（LT），各處理設置4次生物學重復。各處理結束后采集完全展開的功能葉片用錫箔紙包裹并編號（CK組編號為：CK-1、CK-2、CK-3和CK-4；LT組編號為：LT-1、LT-2、LT-3和LT-4），將包裹好的葉片迅速置于液氮中速凍，最后轉移至-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2方法

1.2.1轉錄組測序將8份樣品（CK-1、CK-2、CK-3、CK-4、LT-1、LT-2、LT-3和LT-4）委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行樣品RNA的提取、質控、建庫及轉錄組測序，用llluminaNovaseq 6000平臺進行測序。

1.2.2數據分析將測序所獲得的clean reads與秋茄參考基因組（https：//bigd.big.ac.cn/gwh/Ass-embly/990/show）進行比對并統計比對率，比對分析軟件為HISAT。

FPKM（fragments per kilobase million）即每100萬條序列中，每個基因以1000個堿基為單位，比對上的reads。以FPKM值計算基因表達量，計算軟件為RSEM。

基于表達量定量結果進行組間差異基因分析，獲得2組間發生差異表達的基因，差異分析軟件為DESeq2，篩選閾值為llog2FCI≥1和padjust<0.05。同時利用美吉生物云平臺（https：//cloud.majorbio.com）對篩選得到的DEGs進行GO功能注釋和KEGG富集分析。

1.2.3qRT-PCR驗證

為驗證測序結果準確性，本研究選擇了6個KoHB-others和5個ABA信號途徑DEGs進行實時熒光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR）驗證。利用primer 5.0軟件對所挑選基因進行特異性引物設計，內參基因為引物及內參序列見表1，以法計算DEGs的相對表達水平。

2結果與分析

2.1測序數據質控分析

對秋茄葉片樣品進行RNA提取后，經轉錄組測序獲得樣品原始數據。通過排除低質量數據和序列拼接，獲得了48669538～61694828的Cleanreads（即質控后測序數據的總條目數），錯誤率僅為0.02%左右，Q20均高于98.14%，Q30均高于94.41%，GC含量在45.11%～45.60%（表2）。同日寸，樣品主成分分析結果（圖2）表明：CK組與LT組各處理分別聚為一類，說明樣品間的生物學重復性較好。因此，本研究的轉錄組測序結果較理想，后續的分析較可信。

2.2與參考基因組對比

本研究參考基因為Kandelia obovata（https：//bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/990/show）．所參考基因組版本為k001。通過將質控后的cleandata與參考基因組進行對比發現，實驗所產生的測序序列的比對率均高于96%（表3），包括總比對（能定位到基因組上的clean reads數目）、多方比對（在參考序列上有多個比對位置的cleanreads數目）和唯一比對（在參考序列上有唯一比對位置的Clean reads數目）。

2.3轉錄因子分析

本研究轉錄組測序共鑒定到148個轉錄因子，分屬于25個轉錄因子家族，其中，ERF、NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP、HB-other和MYB-related等轉錄因子家族所包含的基因數目較多，分別占11.49%、9.46%、8.11%、8.11%、6.76%、6.08%、4.05%和4.05%（表4）。其中，HB-other家族轉錄因子包含6個DEGs，KoHB-otherl（Maker00002036）、KoHB-other2（Maker00003789）和KoHB-other3（Maker00008096）下調表達，KoHB-other4（Maker00014773）、KoHB-other5（Maker00016058）和KoHB-other6（Maker00017922）上調表達（圖3）。

2.4差異表達基因鑒定

以P<0.05、上下調差異倍數FC>2或者FC<0.5為篩選條件，進一步對DEGs數量進行統計學分析。結果表明，LT組和CK組的DEGs共有1330個，其中，698個DEGs上調表達（52.48%），632個DEGs下調表達（47.52%）（圖4）。

2.5差異表達基因KEGG通路富集分析

從基因數量上看，DEGs主要富集在植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、植物與病原體互作、淀粉與蔗糖代謝、MAPK信號通路．植物、半乳糖代謝、光合作用·天線蛋白和a一亞麻酸代謝等通路中（表5）。以P值作為參考，DEGs則顯著富集在苯丙素的生物合成、植物激素信號轉導、光合作用·天線蛋白、半乳糖代謝、角質、亞伯堿和蠟的生物合成和a-亞麻酸代謝等通路中（表6）。綜合基因數量和P值看，低溫脅迫下秋茄葉片DEGs顯著富集在植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、半乳糖代謝、光合作用．天線蛋白和a-亞麻酸代謝這5條KEGG通路上，其中，植物激素信號轉導通路中富集到的DEGs數量最多，且差異顯著性最高。

2.6脫落酸信號途徑相關基因挖掘

ABA信號途徑是植物激素信號轉導通路中一條重要激素途徑，對該途徑中的DEGs進行深入挖掘發現，KoPYL1（Maker00013579）、KoABF1（Maker00005324）和KoABF2 （Maker00011633）基因上調表達，KoPP2C1（Maker00008505）和（Maker00004855）基因下調表達（圖5）。

2.7qRT-PCR驗證

對重點關注的6個KoHB-others和5個脫落酸信號途徑DEGs進行了qRT-PCR驗證，結果表明這11個基因的變化趨勢與轉錄組測序結果一致（圖6），表明轉錄組數據準確可靠。

3討論

轉錄組測序（RNA-seq）技術對基因挖掘具有較高的準確性和靈敏性，被廣泛用于擬南芥、油菜（Brassica rapa L）、新疆野蘋果（Malussieversii （Ledeb.） Roem.）等多種植物耐寒基因的研究中，使植物抗寒分子機制被不斷地深入發掘。本研究中，各樣品Q20堿基百分比均大于98%，且Q30堿基百分比均大于94%，GC含量介于45%～46%，測序序列與參考基因組的比對率均高于96%。此外，qRT-PCR結果顯示，所挑選DEGs的變化趨勢與轉錄組結果基本一致。因此，本研究轉錄組測序數據結果良好，可滿足后續分析需求。

轉錄因子通過與脅迫應答基因啟動子中的特定順式作用元件結合，成為植物抗非生物脅迫的主要中介因子，從而使植物能夠抵御不利的環境條件。ERF、NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP和MYB-related等家族轉錄因子參與了多種植物的非生物脅迫響應過程，在對擬南芥、沙冬青（Ammopiptanthus Mongolicus （Maxim. exKom.） Cheng f.）、煙草（Nicotiana tabacumL．）、山荊子、玉米和水稻等的研究發現，相關家族轉錄因子均能一定程度上提升植株的耐寒性，有些甚至是適應冷脅迫所必須的。值得關注的是，HB-other轉錄因子響應非生物脅迫的研究較少，僅在臍橙（Citrus sinensis Osbeck）和地梢瓜（Cynanchumthesioides（Freyn）K．Schum）的干旱脅迫響應中被鑒定到，而在低溫脅迫的相關研究中尚未見報道。在本研究中，共鑒定到148個轉錄因子，分屬于25個轉錄因子家族，其中，ERF．NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP、HB-other和MYB-related等轉錄因子家族所包含的基因數目較多。這些轉錄因子中除HB-other在抗寒相關的研究中未被鑒定到外，其余均被鑒定到并被證明是與抗寒相關的重要轉錄因子家族，特別是bHLH、MYB-related和WRKY在前期秋茄抗寒相關的研究中被認定為低溫應激反應中有價值的候選調節因子在本次秋茄低溫脅迫中首次鑒定出HB-other轉錄因子，并且KoHB-others的表達情況與qRT-PCR驗證結果一致，推測其可能對秋茄響應低溫脅迫起重要調控作用，在后期的研究中還有待被證實。

京都基因和基因組百科全書（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）是用于分析代謝途徑、生物系統和基因功能的信號通路數據庫。許多KEGG通路與植物響應低溫脅迫有關，如橄欖（Canarium album （Lour.）Rauesch.）在低溫脅迫下的DEGs富集到了a-亞麻酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、光合．天線蛋白和晝夜節律相關等通路上，文冠果（Xanthocerassorbifolium Bunge）在低溫脅迫下DEGs顯著富集在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝和氨基酸代謝等通路上。本研究中，秋茄葉片DEGs顯著富集在植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、半乳糖代謝、光合作用-天線蛋白和a-亞麻酸代謝等多條KEGG通路上，且這些通路已經被大量研究證實與抗寒相關，其中，植物激素信號轉導、a-亞麻酸代謝和苯丙酸生物合成等通路在前期秋茄抗寒相關的研究中已經得到證明。因此，植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、半乳糖代謝、光合作用．天線蛋白和a-亞麻酸代謝等是秋茄響應低溫脅迫的重要KEGG通路。

植物激素是一種小的內源性信號分子，如ABA、茉莉酸和生長素等，在響應非生物脅迫過程中參與信號轉導途徑。ABA是植物適應低溫脅迫的重要信號分子，并且其響應低溫脅迫的“PYR／PYL／RCAR—IPP2Csl-SnRK2-ABF／AREB-靶基因”途徑已經研究的較為清晰。ABA信號途徑基因已在許多植物中被鑒定和研究。Zhang等研究發現，擬南芥過表達的尺CAAR12或RCAR13可以通過誘導低溫響應基因CBFs的表達來耐受低溫脅迫。Ren等在葡萄愈傷組織和擬南芥中過表達VaPYL4基因可增強轉基因株系的耐寒性。大量研究表明，PP2Cs負向調控ABA信號途徑；但Hu等在煙草中過表達玉米根部的ZmPP2C2基因增強了煙草對低溫脅迫的耐受性，表明ZmPP2C2基因可能是玉米抗寒性的正向調控基因，這與大部分抗寒相關的研究結論相反，這可能是ZmPP2Cs的調控方式具有特殊性，具體原因還有待進一步的研究。高山離子芥（Chorisporabungeana Fisch. et Mey.）的CbABF1在煙草中表達提高了植株對冷脅迫的耐受性，且轉基因植株的存活率高于野生型。在本研究中，KoPYL1（Maker00013579）．KoABF1（Maker00005324）和KoABF2（Maker00011633）上調表達，KoPP2C1（Maker00008505）和KoABF3（Maker00004855）下調表達，這和其他植物的相關研究結果一致，且這些基因的表達情況與qRT-PCR驗證結果一致。因此，KoPYL1、KoPP2C1、KoABF1、KoABF2和KoABF3基因可作為后期研究秋茄響應低溫脅迫的重要候選基因。

4結論

ERF、NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP、HB-other和MYB-related等家族轉錄因子對秋茄響應低溫脅迫起重要調控作用；植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、半乳糖代謝、光合作用．天線蛋白和a-亞麻酸代謝等是秋茄響應低溫脅迫的重要KEGG通路；ABA信號途徑中的KoPYL1、KoPP2C1、KoABF1、KoABF2和KoABF3等基因可作為后期研究秋茄響應低溫脅迫的重要候選基因。