杉木連栽氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)與硝態(tài)氮含量的關(guān)系

陳雯雯 王淑真 姜寧杰 周垂帆

關(guān)鍵詞：杉木人工林；地力衰退；硝態(tài)氮；氨氧化古菌；土壤酶；連栽代數(shù)

杉木（Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.）是我國南方重要的速生用材樹種，憑借出材率高、材質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性廣和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，在我國南方地區(qū)廣泛種植。然而，隨著杉木純林面積的不斷擴(kuò)大，多代連栽等不合理的營林措施導(dǎo)致了土壤中養(yǎng)分含量的減少，從而引起地力衰退等問題。杉木連栽是指原有林分皆伐后用實生苗在原處進(jìn)行重新造林的過程。連栽導(dǎo)致林地生產(chǎn)力逐代降低，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性下降，土壤酶活性和氮、磷等元素有效性下降。當(dāng)前研究普遍認(rèn)為，植物對不同形態(tài)氮素的利用具有一定的偏好性。張彥東等研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)針葉樹種偏好吸收NHa+-N：李常誠等利用15N同位素示蹤法研究不同林齡杉木的養(yǎng)分吸收偏好時也發(fā)現(xiàn)，3種林齡的杉木均表現(xiàn)出對NH4+-N的較強(qiáng)吸收偏好；但也有研究表明，杉木對N03-N的偏好性大于N H4+_N。植物吸收和利用氮素的過程很復(fù)雜，即使是在同一生態(tài)系統(tǒng)，環(huán)境條件相同，同一植物亦會在林齡、栽植代數(shù)不同時采用不同的氮素獲取策略。目前部分學(xué)者己從多個角度探究了杉木連栽對土壤硝態(tài)氮含量的影響，但尚未達(dá)成一致結(jié)論。劉先等發(fā)現(xiàn)，杉木人工林硝態(tài)氮含量并未隨著連栽代數(shù)增加而減少；而陳鄭洪等研究表明，隨著連栽代數(shù)的增加，連栽杉木人工林土壤硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)降低趨勢。目前關(guān)于杉木連栽林硝態(tài)氮相關(guān)研究的不足，限制了人們對硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化過程隨多代連栽變化的認(rèn)知。

微生物活動與土壤氮循環(huán)密切相關(guān)，可以說氮循環(huán)的本質(zhì)就是微生物驅(qū)動的氮素轉(zhuǎn)化、利用及循環(huán)的過程，需要植物、真菌、細(xì)菌和古菌等共同參與。土壤氮素在微生物作用下最終成為植物可直接吸收利用的有效氮，其中，硝化作用是氮循環(huán)的核心環(huán)節(jié)，此過程能夠提高土壤氮的有效性。氨氧化過程被認(rèn)為是硝化作用的限速步驟，主要由氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）完成，它們能將氨（NH3）氧化成亞硝態(tài)氮（N02-），進(jìn)而推動硝化反應(yīng)的進(jìn)程。氨氧化古菌是酸性土壤氨氧化反應(yīng)的主要催化者，如賀紀(jì)正等對長期施肥處理引起的土壤性質(zhì)變化研究中發(fā)現(xiàn)，酸性條件下氨氧化古菌的豐度和群落組成變化比氨氧化細(xì)菌更明顯。Lu等通過穩(wěn)定性同位素示蹤實驗證明，氨氧化古菌類群主導(dǎo)了森林土壤氨氧化過程。然而，以往研究多聚焦于不同生態(tài)環(huán)境、條件處理下氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)和物種豐度變化以及氨氧化古菌在人工給水和污水處理系統(tǒng)中群落分布和所起作用，關(guān)于自然條件下多代連栽杉木純林土壤中的氨氧化古菌群落組成和有效氮素形態(tài)轉(zhuǎn)變規(guī)律的研究較為罕見。

土壤酶是氮循環(huán)過程中關(guān)鍵的催化劑，對土壤物化性質(zhì)的改變極其敏感。前人研究表明，不同栽植代數(shù)會改變杉木林的氮循環(huán)特征。土壤微生物是土壤氮循環(huán)過程的主要驅(qū)動力，直接調(diào)節(jié)土壤有機(jī)質(zhì)和氮素養(yǎng)分的供給和轉(zhuǎn)化。土壤酶能夠表征微生物活性，不同的土壤酶參與土壤氮循環(huán)，將土壤中不同形態(tài)N分解為有效N供植物吸收。目前對杉木人工林酶活性的研究主要關(guān)注脲酶、過氧化氫酶等，且大部分結(jié)果表明，隨杉木連栽代數(shù)增加酶活性逐代下降，但對于參與土壤氮循環(huán)過程，尤其是參與土壤硝化、氨氧化過程的酶如氨單加氧酶（AMO）則較少涉及。因此，研究不同栽植代數(shù)的杉木人工林土壤氮循環(huán)過程中酶活性變化及其影響因子，對提高土壤N素利用率和人工林生態(tài)恢復(fù)管理有重要意義。

鑒于此，本研究選擇不同栽植代數(shù)的杉木人工林土壤為研究對象，利用高通量測序技術(shù)研究杉木連栽對土壤有效態(tài)氮形態(tài)特征的影響，通過分析連栽杉木土壤中的氨氧化古菌群落組成及多樣性，以揭示氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性隨連栽代數(shù)演變的規(guī)律及有效氮素與氨氧化古菌群落的相關(guān)性，最終確定影響連栽杉木林土壤氮有效性的因素，旨在為我國杉木人工林的可持續(xù)經(jīng)營提供實踐指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1研究區(qū)概況與樣品采集

研究林分位于福建省南平市王臺鎮(zhèn)（118°～119°E，26°40～27°20'N），屬武夷山系南伸支脈，是我國杉木中心產(chǎn)區(qū)之一。平均海拔200m左右，地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年均氣溫19.3℃，相對濕度83%，年均降水量1700mm，主要集中在春夏季。土壤是由燕山晚期白云母化中細(xì)?；◢弾r發(fā)育的山地暗紅壤，土層厚度在100cm以上。該地栽植有4個不同代數(shù)的杉木人工林，其中，1代林林齡18a；2代林林齡18a；3代林林齡19a；4代林林齡16a。該林分喬木層主要以杉木為主，1代林土地植被覆蓋度較高，灌木層植物主要有山蒼子（Litsea cubeba （Lour.） Pers.）、毛冬青（llex pubescens Hook. et Arn.）、鹽膚木（Rhus chinensis Mill.）等；草本層植物主要有芒萁（Dicranopterisdichotoma （Thunb.）Berhn.）、烏毛蕨（Blechnum orientale Linn.）、狗脊、觀音蓮座蕨等。2代林灌木層植物主要有粗葉榕、草珊瑚（Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai）等，草本層植物主要有狗脊、雙蓋蕨、扇葉鐵線蕨等。3代與4代植被豐富度則顯著下降，灌木層植物主要有粗葉榕（Ficus hirta Vahl）、毛冬青等；草本層植物主要有芒萁、狗脊等。通過以空間代時間的方法，于2021年10月，選擇立地條件相似、林齡為18a左右的中林齡、代數(shù)分別為1～4代（G1～G4）的杉木人工林進(jìn)行采樣，樣地基本理化性質(zhì)見表1。每片林地選擇3個坡度在30°～40°，海拔、坡向相近的土坡。每個土坡上劃分20m×20m的采樣地，沿著S型采集6份樣品，去除枯枝落葉后，用土鉆鉆取深度為20cm的表層土壤，并將6份樣品等量混合為一份。每片人工林采集3份樣品，每份土壤過20目篩后放人4℃冰箱內(nèi)冷藏保存，一部分用于土壤理化性質(zhì)測定，另一部分用于氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性測定。

1.2土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH值采用pH計（ST3100-FOhaus，New Jersey，美國）測定：稱取10g風(fēng)干土倒入50mL燒杯，加入25mL水（去C02純水，水土比2.5：1），混合攪拌靜置30 min后用pH計測定；土壤硝態(tài)氮（N03-N）、銨態(tài)氮（NH4+-N）含量使用全自動連續(xù)流動分析儀（AA3 SEALAnalytical，荷蘭）測定，土壤樣品經(jīng)過2mol.L-1KCI溶液浸提后上機(jī)測定；土壤微生物量氮（MBN）含量采用氯仿熏蒸浸提法測定，未熏蒸土樣加入120mL 0.5mol.L-1K2S04溶液（水土比4：1）浸提，直接震蕩過濾，熏蒸土樣在真空干燥器中加入氯仿熏蒸，培養(yǎng)24h后浸提，過濾膜后上總有機(jī)碳分析（TOC-LCPH，Shimadzu，Japan）測定，直接得出未熏蒸樣品的總可溶性氮（TSN）含量，計算熏蒸與未熏蒸樣品的總可溶性氮（TSN）含量差值，得到土壤微生物量氮（MBN）含量，轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.54。

1.3土壤酶測定

土壤酶活性使用試劑盒進(jìn)行測定，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。酶活性均使用酶標(biāo)儀（SpectraMaxM4，美國）測定。

土壤氨單加氧酶（S-AMO）：測定原理為氨單加氧酶與HRP標(biāo)記的抗體結(jié)合，形成抗體．抗原．酶標(biāo)抗體復(fù)合物，再經(jīng)洗滌、顯色、酸化，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度值，即可反應(yīng)樣品氨單加氧酶活性。

土壤脲酶（S-UE）：測定原理為脲酶水解尿素所產(chǎn)生的NH3在強(qiáng)堿性介質(zhì)中能夠與次氯酸鈉和苯酚反應(yīng)，生成水溶性藍(lán)色染料靛酚藍(lán)，在630nm處具有特征吸收峰，通過吸光值的變化可表征土壤脲酶的活性。

土壤過氧化氫酶（S-CAT）：測定原理為H202在240nm處具有特征吸收峰，土壤過氧化氫酶分解H202使反應(yīng)溶液在240nm處吸光值隨反應(yīng)時間而下降，通過測定吸光值的變化率即可表征土壤過氧化氫酶的活性。

1.4土壤氨氧化古菌測定

完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，采用引物Arch-amoAF（GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC）、Arch-amoAR（GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG）對土壤中amoA（26-417）區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增目的條帶大小，并用Agencourt AMPureXP核酸純化試劑盒純化，隨后完成Miseq文庫構(gòu)建。將符合要求的測序文庫在lllumina Miseq平臺上進(jìn)行雙末端測序（Paried-End），對基因進(jìn)行物種注釋后得到各分類水平上的氨氧化古菌的相對豐度。

1.5數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)分布檢驗，通過SPSS 25.0軟件對組間土壤氮素含量和氨氧化古菌Alpha多樣性指數(shù)分別進(jìn)行單因素方差分析，以0.05的顯著性水平為樣品均值比較的最小顯著差異檢驗。土壤氮素含量、酶活性及氨氧化古菌群落相對豐度冗余分析（RDA）使用Canoc05完成。疊加熱圖的Mantel r分析和中性群落模型使用在線作圖平臺完成。利用R Studio軟件完成隨機(jī)森林模型和偏最小二乘路徑模型以探究土壤氨氧化古菌、酶活性與硝態(tài)氮之間的響應(yīng)關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1不同代數(shù)杉木林土壤有效氮含量與酶活性

由圖1可知：代數(shù)對杉木林土壤理化性質(zhì)影響顯著，不同土壤理化性質(zhì)隨連栽代數(shù)的變化趨勢不同。隨代數(shù)增加，土壤硝態(tài)氮（N03-N）呈顯著下降趨勢（圖1b），而土壤銨態(tài)氮（NH4+-N）和土壤微生物量氮（MBN）含量變化趨勢并不明顯且各代之間差異不顯著（圖1a、c）。對不同代數(shù)杉木林土壤酶活性進(jìn)行分析，過氧化氫酶（S．CAT）在不同代數(shù)杉木林土壤中基本呈降低趨勢（圖1e），G1時3種酶活性均最高，G3時脲酶（S-UE）和氨單加氧酶（S-AMO）均為最低值（圖1d、圖1f），除了過氧化氫酶，測定的脲酶和氨單加氧酶隨代數(shù)增加均表現(xiàn)出先降后升的趨勢，表明土壤酶活性的高低與杉木連栽有密切關(guān)系。

2.2不同代數(shù)杉木林土壤中氨氧化古茵豐度與多樣性分析

通過Alpha多樣性指數(shù)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，其中，物種豐度變化能通過豐富度指數(shù)（Chao1）變化體現(xiàn)，群落多樣性能通過多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）變化體現(xiàn)。從圖2氨氧化古菌Alpha多樣性指數(shù)變化可知：隨連栽代數(shù)增加，Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)總體表現(xiàn)為先降再升再降趨勢，在G1、G3時最高，G4時最低，且G1～3和G4之間差異顯著；而Shannon指數(shù)總體表現(xiàn)為先升后降趨勢，G2時最高，G4時顯著降低。綜上，土壤中氨氧化古菌豐富度和多樣性指數(shù)總體表現(xiàn)為隨代數(shù)下降趨勢。

不同代數(shù)杉木林土壤樣本中共檢測出14個菌門，如圖3所示，土壤氨氧化古菌在門類水平上，相對含量較高的為變形菌門（Proteobacteria），隨代數(shù)的增加呈先升后降趨勢，從G1（1.24%）到G3（1.64%）時升高，G4（0.53%）時最低；屬分類水平上，優(yōu)勢類群為慢生根瘤菌屬慢生根瘤菌屬呈現(xiàn)先降再升再降的趨勢，G3（1.03%）時升高，G4（0.21%）時最低，與Opitutus（G3：0.14%;

G4：0.23%）先升再降再升的趨勢相反；種分類水平上，Bradyrhizobiumottawaense相對含量在G2（0.24%）和G4（0.18%）時顯著降低；Opitutus_ terrae則在G2（0.24%）和G4（0.23%）時升高。隨代數(shù)增加，亞硝化球菌屬（ G3：0.005%；G4： 0）、嗜酸菌屬（G2：0.21%；G4：0.05%）

和Nitrosopumilus（G3：0.03%;G4：0.002%）變化趨勢相同，均呈先升高后降低趨勢，在G2、G3時升高，G4時降低。鹽長壽菌屬則呈逐代降低趨勢，G1（0.02%）時最大，G2后無豐度值。本研究還發(fā)現(xiàn)，放線菌門（Actinobacteria）相對含量在G3（0.32%）時最高，G4（0.05%）時最低；酸桿菌門（Acidobacteria）從G1（0.07%）到G4（0.03%）明顯降低；Acidiphilium multivorum（G2：0.21%;G4：0.05%）、Nitrosopumilus_cobalaminigenes（G3：0.03%;G4：0.002%）和Nitrososphaera_ viennensis（G3：0.005%;G4： 0）的變化趨勢基本一致，均在G2、G3時升高，G4時降低。

由于本次高通量測序是將amoA基因作為標(biāo)記從分子水平上進(jìn)行探究，采用引物Arch-amoAF（GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC）、Arch-amoAR（GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG）對土壤中amoA（26-417）區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與同是amoA基因作為標(biāo)記的氨氧化細(xì)菌的引物amoA-1F（GGGGTTTCTACTGGTGGT）、amoA-2R（CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC）相似，本次土壤氨氧化古菌測定結(jié)果在不同分類水平上也檢測出部分細(xì)菌。

為了明確隨機(jī)過程對不同栽植代數(shù)杉木人工林氨氧化古菌群落組裝的潛在重要性，通過中性群落模型（NCM）評估群落中OTU出現(xiàn)頻率與相對豐度之間的關(guān)系。如圖4所示，藍(lán)色實線表示中性群落模型的最適擬合值，藍(lán)色虛線代表模型的95%置信區(qū)間，出現(xiàn)頻率高于或低于中性群落模型預(yù)測的OTU以不同顏色顯示。結(jié)果顯示：中性群落模型能夠估計OTU的出現(xiàn)頻率與相對豐度變化之間的一部分關(guān)系，R2值（R2=0.43）在氨氧化古菌群落中具有合理的解釋率（R2>0.4），較小的m值說明在群落中物種擴(kuò)散受限制。總的來說，隨機(jī)過程在不同栽植代數(shù)杉木人工林氨氧化古菌群落的空間分布較為重要，但也受擴(kuò)散限制。

2.3土壤理化性質(zhì)、酶活性與氨氧化古菌豐度和多樣性的冗余分析

對不同代數(shù)杉木林土壤理化性質(zhì)、酶活性與氨氧化古菌豐度和多樣性進(jìn)行冗余分析，如圖5所示，箭頭線段越長，表示研究對象影響程度越高，反之則相反；箭頭間的夾角表示二者之間的相關(guān)關(guān)系，夾角越接近0°，二者越呈正相關(guān)關(guān)系，夾角越接近180°，二者越呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。第一排序軸（RDA1）解釋群落變化的42.15%，第二排序軸（RDA2）解釋群落變化的57.85%。在所有土壤理化性質(zhì)中，N03-N對Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)以及Shannon指數(shù)影響最大，呈正相關(guān)關(guān)系，而pH、TN與之呈負(fù)相關(guān)；TSN、SON與Chaol指數(shù)呈正相關(guān)。S-AMO與pH、TN呈正相關(guān)，與TSN呈負(fù)相關(guān)；S-UE與NH4+-N呈負(fù)相關(guān)；S-CAT與pH呈正相關(guān)。酸桿菌門和廣古菌門（Euryarchaeota）與N03--N呈正相關(guān)，與NH4+-N呈負(fù)相關(guān)；變形菌門和奇古菌門（Thaumarchaeota）與N03-N呈正相關(guān)，與pH、TN呈負(fù)相關(guān)；放線菌門與TSN呈正相關(guān)，與S-AMO呈負(fù)相關(guān)。

2.4氨氧化古菌與土壤理化性質(zhì)和酶活性之間的Mantel r相關(guān)性分析

以Mantel r對2個矩陣相關(guān)性進(jìn)行檢驗。p值越小，Mantel r的相關(guān)性系數(shù)越大，說明環(huán)境因子對微生物群落的影響越大，且它的偏分析可以排除環(huán)境因子之間自相關(guān)的干擾。結(jié)果（圖6）表明：AOA對DOC的影響最大，呈極顯著正相關(guān)（p<0.01），AOA與TC、TN呈顯著正相關(guān)（p<0.05）。TC與TN呈強(qiáng)顯著正相關(guān)（p<0.001），TSN與SON呈極顯著正相關(guān)（p<0.01），與S-AMO呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.05）；N03--N與MBN呈顯著正相關(guān)（p<0.05），與pH呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.05），SON、DOC與TC、TN呈顯著負(fù)相關(guān)（p<0.05）。

2.5氨氧化古茵豐度與多樣性各因素對土壤硝態(tài)氮的重要性分析

利用隨機(jī)森林模型（RF）和偏最小二乘路徑模型（PLS-PM）分析氨氧化古菌豐度與多樣性各因素對土壤硝態(tài)氮的相對重要性，圖7表明：各指標(biāo)對硝態(tài)氮均有一定影響。隨機(jī)森林模型（圖7a）表明：氨氧化古菌Alpha多樣性指數(shù)對硝態(tài)氮影響最大，其中，Ghao1指數(shù)是影響硝態(tài)氮的最重要因素。偏最小二乘路徑模型（圖7b）表明：對硝態(tài)氮的直接影響最明顯的是氨氧化古菌Alpha多樣陛指數(shù)（0.767），其次是群落相對豐度（-0.347）。

3討論

3.1杉木連栽對土壤有效氮含量和酶活性的影響

硝態(tài)氮與銨態(tài)氮是土壤有效氮存在的2種主要形式，是植物可直接利用的氮源。本研究中，隨栽植代數(shù)增加，土壤中N03-N含量逐漸降低，NH4+-N含量變化不明顯，這與Chen等的研究結(jié)果相似。一方面是土壤NH4+-N帶正電，容易被土壤膠體吸附留存于土壤中，而N03-N帶負(fù)電，移動性強(qiáng)，在酸性土壤中容易流失，且更易于被植物利用。另一方面可能反應(yīng)出土壤為適應(yīng)氮素匱乏而采取的保氮機(jī)制，盡管土壤全氮未見明顯下降，但土壤礦化率升高，硝化率降低，能夠減少土壤氮流失的風(fēng)險，這與Chen等的研究結(jié)果相似。土壤氮有效性很大程度上是通過氮礦化過程來調(diào)控，該過程在微生物參與下將土壤有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮。有報道表明，隨著連栽代數(shù)增加，杉木林土壤中氨氧化古菌的數(shù)量和種類有所下降，這可能是導(dǎo)致土壤N03-N含量降低的原因。土壤微生物量氮是土壤有機(jī)氮中最活躍的組分，也是土壤氮循環(huán)和轉(zhuǎn)化過程中的重要參數(shù)。本研究相關(guān)分析表明，土壤MBN與土壤N03-N呈顯著正相關(guān)，表明硝化過程是影響土壤微生物量氮的一個重要因素，這與劉金熾等的研究結(jié)果相似。由于多代連栽抑制了土壤的硝化作用，土壤中微生物可利用的物質(zhì)減少，微生物量氮礦化分解步驟減少，從而降低了土壤微生物量氮含量。

其次，土壤酶是促進(jìn)土壤氮循環(huán)過程的催化劑。酶活性高低不僅能夠反應(yīng)微生物化學(xué)過程的強(qiáng)度和方向，還可表征土壤養(yǎng)分元素的動態(tài)變化。土壤過氧化氫酶在微生物代謝過程中起著重要作用，它參與土壤中許多重要的生物化學(xué)過程，其活性與土壤氮素關(guān)系密切。土壤脲酶是有機(jī)氮礦化和氮動態(tài)調(diào)節(jié)的重要指標(biāo)，它能促進(jìn)尿素水解生成氨，是林木氮素營養(yǎng)的直接來源。本研究中，土壤脲酶、過氧化氫酶活性均隨代數(shù)增加呈降低趨勢，這與張威等的研究結(jié)果一致。由于杉木連栽代數(shù)的增加，土壤中有機(jī)殘體分解速度及腐殖質(zhì)合成能力明顯下降，這可能與酶促作用底物濃度降低有關(guān)。因為土壤有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)數(shù)量減少，使土壤黏粒含量和微生物數(shù)量下降，這些變化導(dǎo)致了土壤酶活性下降。胡亞林等研究證實，杉木凋落物的數(shù)量與土壤酶活性呈顯著正相關(guān)，杉木屬常綠針葉樹種，枝葉常年不易掉落，林下凋落物總類和數(shù)量較少，因此，不同連栽代數(shù)杉木人工林地凋落物可能也是影響土壤酶活性的原因之一。氨單加氧酶（AMO）是參與土壤氨氧化過程的關(guān)鍵功能酶，包含amoA、amoB、amoC三個亞基。氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌都含有氨單加氧酶基因，amo亞基常作為研究氨氧化微生物的分子標(biāo)記，來研究自然環(huán)境中氨氧化微生物的豐度和多樣性。本研究中，土壤AMO活性隨代數(shù)增加呈先降低后升高的趨勢。由于AMO是驅(qū)動土壤中氨氧化微生物向有效氮養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，隨著栽植代數(shù)的增加，土壤微生物活性逐漸降低，礦化速率逐漸減慢，影響著AMO的活性，更對杉木多代連栽過程土壤養(yǎng)分的活化、周轉(zhuǎn)和積累產(chǎn)生顯著影響。

3.2杉木連栽對土壤氨氧化古菌群落豐度與多樣性的影響

微生物群落在土壤中處于一個動態(tài)平衡的過程，任何影響土壤理化性質(zhì)的因子都會干擾土壤微生物群落的變化，進(jìn)而影響微生物的活性、生態(tài)功能及土壤肥力。本研究中，土壤AOA豐度與多樣性大致呈現(xiàn)逐代降低趨勢，杉木多代連栽抑制了AOA的生長。前人研究表明，森林土壤微生物中存在一種“杉木連栽土壤存在中毒物質(zhì)”的觀點(diǎn)，由Mikola、Mazzola等研究者確立起來，證實了森林土壤比耕作土壤具有更強(qiáng)的毒性，并認(rèn)為這種森林土壤中毒的現(xiàn)象可能來自于土壤微生物。同時，馮宗煒等也在湖南會同森林生態(tài)實驗中證實，杉木連栽土壤存在毒性物質(zhì)，杉木的凋落物便是杉木自毒物質(zhì)的來源之一，主要是一些酚醛類化合物影響了土壤微生物的數(shù)量和分布。本研究Mante r分析表明，土壤AOA和DOC、TC、TN均呈顯著相關(guān)性。不同代數(shù)連栽意味著不同的林分養(yǎng)分狀況和微生態(tài)條件，因此，氨氧化古菌群落形成了對各連栽代數(shù)土壤環(huán)境的反應(yīng)。對于連栽人工林來說，凋落物是林地的主要養(yǎng)分來源，森林土壤的毒性（鐮刀菌屬真菌作為主要病原菌）和多種土壤養(yǎng)分含量的變化，對AOA群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生了復(fù)雜的影響，進(jìn)而影響到土壤硝態(tài)氮含量。也有研究認(rèn)為，土壤AOA的豐度與多樣性由它們的生態(tài)特征決定，一定程度上，微生物群落結(jié)構(gòu)與地上種群有關(guān)，林下植被的變化對土壤微生物群落的組成也有顯著影響，從G1到G4，林下植被種類逐漸單一、生物多樣性降低，杉木細(xì)根生物顯著減少，根系分泌物發(fā)生改變，導(dǎo)致AOA群落豐度與多樣性逐代下降。說明AOA豐度與多樣性變化會受到土壤理化性質(zhì)的影響。

本研究中，氨氧化古菌測定結(jié)果在不同分類水平上也檢測出部分細(xì)菌的存在。典型氨氧化過程被認(rèn)為是一個由變形菌綱中的一小部分細(xì)菌類群所進(jìn)行的專性好氧的化能自養(yǎng)過程，而氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌的功能類似，都利用amoA基因作為標(biāo)記從分子水平上進(jìn)行氨氧化作用。有研究表明，16S rRNA基因由于多拷貝和基因組內(nèi)部異質(zhì)性，因此，導(dǎo)致對氨氧化微生物多樣性分析的偏差。土壤銨態(tài)氮含量對氨氧化古菌的奇古菌門和廣古菌門有直接影響作用，銨態(tài)氮含量變化與之密切相關(guān)。根據(jù)土壤理化性質(zhì)的分析，銨態(tài)氮含量隨代次呈現(xiàn)先升后降趨勢，第3代時最高，這與奇古菌門及亞硝化球菌屬相對豐度變化一致。其次，相關(guān)分析結(jié)果顯示，NH4+-N與奇古菌門呈正相關(guān)，與廣古菌門呈負(fù)相關(guān)，這與Zhalnina等的研究結(jié)果一致。Jiao等在玉米和水稻土壤古菌試驗中發(fā)現(xiàn)，亞硝化球菌屬為奇古菌門的優(yōu)勢種，同時也是硝化過程的氨氧化劑，從1代至3代，由于土壤吸附住的銨態(tài)氮含量的升高，導(dǎo)致NH3對氨氧化劑的可用性增大，從而提高了奇古菌門及亞硝化球菌屬相對豐度。變形菌門、放線菌門、酸桿菌門等為氨氧化過程的主要優(yōu)勢菌群，與魏志超等研究結(jié)果相似。由于變形菌門是典型的R策略菌，有機(jī)質(zhì)含量高，pH低的環(huán)境會加速促進(jìn)R策略菌生存和繁殖，從第1代到第4代，pH值升高，這也解釋了變形菌門相對豐度減小的原因。變形菌門需要消耗有機(jī)質(zhì)來供應(yīng)代謝活動所需要的能量，因此，變形菌門與土壤TN呈負(fù)相關(guān)。但也有研究認(rèn)為，土壤變形菌門含量對土壤氮素是起到正向促進(jìn)作用的，如李艷春等研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門代謝活動是土壤中最主要的細(xì)菌活動，隨著土壤氮素含量增加，變形菌門的豐度增加。由于在酸性土壤中，不同林地凋落物的組成成分、數(shù)量與植被根系分布狀況和數(shù)量的不同，森林土壤的空間異質(zhì)性及林分類型的差異也是群落結(jié)構(gòu)差異的原因。本研究中，放線菌門與總可溶性氮和可溶性有機(jī)氮呈正相關(guān)，這與Sekaran等的研究結(jié)果相似。本研究樣品采集地為南方典型酸性壤土，土壤酸桿菌門呈顯著下降趨勢，由于酸桿菌具有嗜酸性，隨連栽代數(shù)增加，pH略微升高，導(dǎo)致土壤酸桿菌逐代減少。放線菌為K對策者，在資源有限的條件下，選擇可維持長期生存狀態(tài)的繁殖策略。綜上，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門對促進(jìn)氮素形態(tài)轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮重要作用。

3.3杉木多代連栽過程中硝態(tài)氮與氨氧化古菌的關(guān)系

不同連栽代數(shù)杉木人工林土壤中硝態(tài)氮與AOA有密切聯(lián)系。AOA主要通過控制硝化關(guān)鍵步驟的氨氧化過程速度及編碼氨單加氧酶2種機(jī)制影響土壤中硝態(tài)氮的含量和轉(zhuǎn)化。一方面，AOA豐度和多樣性特征與土壤環(huán)境因子的響應(yīng)會影響土壤硝態(tài)氮的變化，另一方面AOA編碼AMO能夠影響酶和底物的構(gòu)象及酶對土壤的吸附性等，進(jìn)而影響土壤硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化。Guo等在杉木林轉(zhuǎn)化過程對微生物群落和氮功能基因研究中發(fā)現(xiàn)，變形菌門、酸桿菌門等為優(yōu)勢類群，這與本研究結(jié)果相同，變形菌門和酸桿菌門在森林土壤中具有廣泛的代謝和生理途徑，對土壤氮循環(huán)起重要作用。

在對門水平下的氨氧化古菌類群與土壤酶活性進(jìn)行冗余分析中發(fā)現(xiàn)，N03-N與奇古菌門、廣古菌門呈正相關(guān)，與氨單加氧酶呈負(fù)相關(guān)。Stein等在研究含有銨或亞硝酸鹽的歐洲豬籠草孵化實驗中發(fā)現(xiàn)，一定濃度下的氨氧化作用所產(chǎn)生的亞硝酸鹽會對AMO的活性有削弱作用。本研究中，硝態(tài)氮含量隨代數(shù)逐漸降低，AMO活性在G1～G3時降低，在G4時升高，為此一種可能的機(jī)制是，第1代至第3代土壤進(jìn)行的氨氧化作用所生成的亞硝酸鹽不足以抑制AMO活性，第4代亞硝酸鹽的減少使土壤AMO的活性升高。

長期以來，微生物豐度與多樣性一直被認(rèn)為是調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵因素。土壤微生物群落豐度與多樣性的降低將嚴(yán)重影響到土壤養(yǎng)分的分解、循環(huán)和保留。通過構(gòu)建隨機(jī)森林模型和偏最小二乘路徑模型分析氨氧化古菌豐度與多樣性各因素對土壤硝態(tài)氮的相對重要性，結(jié)果顯示，氨氧化古菌豐度與多樣性是影響硝態(tài)氮的最重要因素，這與鄭有坤等研究結(jié)果一致。Zhou等在連栽C．equisetifolia種植園試驗表明，連栽種植會降低土壤pH值、有機(jī)質(zhì)含量、C/N比和P素，這也顯著改變了土壤微生物群落的組成和多樣性，使得土壤氮有效性降低?？紤]到土壤微生物群落是土壤養(yǎng)分循環(huán)過程（凋落物分解、礦化）的關(guān)鍵驅(qū)動力，同時它本身也是養(yǎng)分有效性的來源和匯。因此在不同栽植代數(shù)的林分中，逐代林下凋落物數(shù)量和分解速率顯著下降，降低了AOA微生物群落豐度及多樣性，從而間接降低了土壤硝態(tài)氮（杉木偏好吸收的有效氮素）的含量。

4結(jié)論

隨杉木連栽代數(shù)增加，銨態(tài)氮變化不明顯，硝態(tài)氮含量顯著下降，除第四代土壤脲酶和氨氮加氧酶酶活性略有上升，土壤氮循環(huán)相關(guān)酶活性基本呈現(xiàn)降低趨勢。氨氧化古菌群落豐度與多樣性總體呈現(xiàn)降低趨勢，表明連栽對氨氧化古菌微生物群落產(chǎn)生顯著影響。不同代數(shù)杉木林AOA群落結(jié)構(gòu)有較大差異，其中變形菌門、放線菌門為優(yōu)勢類群，隨代數(shù)呈現(xiàn)降低趨勢。本研究證實了土壤養(yǎng)分含量與AOA微生物群落以及土壤酶活性之間聯(lián)系密切，AOA對杉木人工林土壤氮素循環(huán)硝化過程起著重要的作用，對有效評判杉木林土壤質(zhì)量變化有重要意義。