白樺BpAMT基因家族鑒定及表達模式分析

楊海昕 劉曉瑩 詹亞光 范桂枝

關鍵詞：白樺；AMT;基因家族；基因表達模式

氮素是植物生長發育過程中所必需的大量營養元素之一，是核酸、蛋白質和葉綠素等大分子物質的重要組成成分。作為植物吸收無機氮素的低耗能方式，銨態氮的吸收利用效率直接影響植物生長發育，吸收過量的銨對植物具有毒性，其吸收和代謝受到嚴格的調控。

銨態氮的吸收主要由銨根轉運蛋白（Ammoniumtransporter，AMT）調控，它將銨根離子從細胞外轉運到細胞內進而調節植株地上部分與地下部分的氮素平衡。隨著測序技術和生物信息學的發展，研究者發現，基因AMT一般包括AMT1和AMT2兩個亞家族，亞家族成員之間具有相似的高級結構，但其基因結構和成員數量不同。在基因結構上，AMT1家族成員一般不含內含子，多為高親和轉運體；AMT2家族成員含多個內含子且位置和大小基本保守，其親和性沒有明確規律；在基因數量上，AMT家族成員一般在6～16個之間。在基因表達上，AMT家族成員在根、莖和葉等的基因表達具有組織部位特異性，同時也受病毒和害蟲等生物以及氮素濃度、光照、植物激素和干旱等非生物因素的調控，如水稻（Oryza sativaL_）OsAMT1.3在根系維管束和側根原基中表達，百脈根（Lotusjaponicas Regel.）LjAMT2.1主要在根瘤細胞的原生質膜上表達，柑橘（Citrus reticulata Blanco.）CitAMT1和棉花（Gossypium hirsutum L_）GhAMT1.3在低氮的條件下表達量大幅度提高，擬南芥（Arabidopsis thaliana L、）AtAMT1.1及轉錄水平隨日變化周期中光照強度的降低而下降。

在自然狀態下，土壤中的氮素受到限制或有效性降低都會限制植株的生長、影響植株對碳同化物質的分配格局以及抵抗脅迫的能力。白樺（Betula platyphyHa Suk.）是喜光耐寒的先鋒樹種，它對土壤適應性強且生長速度較快。研究發現，在一定濃度范圍內隨著供氮水平的增加，白樺幼苗根系、莖和口十中全氮濃度提高，其中，無機氮比有機氮更易于其生物量的積累。AMT作為氮代謝的關鍵基因之一，其家族成員在白樺中的研究還未見報道，尤其是其成員數量及功能還不清楚，有關AMT基因在非生物脅迫條件下表達的研究文獻有限。因此，本研究以10年生白樺樹、2年生白樺盆栽苗及白樺懸浮細胞為試驗材料，基于最新公布的白樺基因組序列，篩選鑒定BpAMT家族成員，初步解析BpAMT家族成員在不同組織、不同氮素條件、日變化周期以及不同激素和非生物脅迫處理后的表達模式，該研究將為深入探究BpAMT家族成員的功能提供參考依據。

1材料與方法

1.1材料

白樺組培苗與懸浮細胞為實驗室保存材料，組培苗培養基為WPM培養基附加蔗糖20g.L-1與瓊脂6.5g.L-1，每25～30d繼代1次；懸浮細胞培養基為B5培養基附加蔗糖20g.L-1、瓊脂8g.L-1、水解酪蛋白1g.L-1、TDZ0.6mg.L-1、6-BA 0.3mg.L-1與2，4-D0.5mg.L-1．每7d繼代1次；10年生白樺樹材料采集于東北林業大學主校區丹青樓前白樺林；2年生白樺盆栽苗培養于東北林業大學逸夫教學樓旁。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析

利用擬南芥AtAMT1.1（CAA53473）. AtAMT1.2 （AAD54639）. AtAMT1.3（AAD54638）. AtAMT1.4 （CAB81458）. AtAMT1.5（NP_189072）和AtAMT2.1（NP_181363）6個AMT序列，在白樺基因組數據中進行比對，數據庫網址為https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank，登錄號為PRJNA285437，剔除重復序列后獲得BpAMT候選基因，進行保守結構域鑒定，確定BpAMT家族成員并進行編號。通過在線分析軟件EXPASY進行理化性質分析；通過在線軟件WoLFPSORT進行亞細胞定位預測；使用MEGAX構建系統進化樹，構樹方法選擇NJ法；使用GSDS2.0繪制基因結構，使用在線MEME對白樺目標氨基酸序列進行比對，并對保守區進行分析；通過在線軟件MG2C繪制基因在染色體上位置；使用TBtools進行共線性分析；運用SPDEv2.0確定啟動子序列，plantcare進行順式作用元件功能預測，導人TBtools進行可視化。

1.2.2表達模式分析

1.2.2.1組織部位表達模式分析于2021年7月15日采集2年生白樺盆栽苗的根、莖和葉組織，每次取材進行3次生物學重復，測量不同組織下BpAMT基因表達情況，采用改良的CTAB法提取總RNA，使用Takara公司ScriptTM RT試劑盒合成cDNA。使用Premier5.0設計定量引物（表1），引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，以白樺微管蛋白基因BpTu為內參基因，進行qRT-PCR分析基因表達模式，目的基因的相對表達量用：表示。運用IBM SPSS Statistics 23軟件對BpAMT基因表達進行統計及顯著性差異分析。

1.2.2.2不同氮素處理下表達模式分析

以含不同氮源的B5培養液處理白樺懸浮細胞，設置對照CK組（正常B5培養液），CKO組（CK組去除NH4N03試劑）、低濃度單一硝態氮組（CKO組添加0.1 mmoI.L-1KN03試劑）、高濃度單一硝態氮組（CKO組添加3mmoI.L-1KN03試劑）、低濃度單一銨態氮組（CKO組添加0.1mmoI.L-1NH4CI試劑）與高濃度單一銨態氮組（CKO組添加3mmoI.L-1NH4CI試劑）為實驗組，分別培養白樺懸浮細胞，每個處理進行3次生物學重復，在1d后取樣測量不同處理下BpAMT基因表達量的變化情況，并進行統計及顯著性差異分析。

1.2.2.3日變化表達模式分析于2020年8月3-4日1個日周期內，每隔3h取樣1次，共9個時間點采集主校區丹青樓前10年生白樺樹葉片，每次取材進行3次生物學重復，對不同時間下BpAMT基因表達量進行統計分析。

1.2.2.4不同激素處理下表達模式分析選擇長勢一致的白樺盆栽苗，分別用100umoI.L-1茉莉酸甲酯（MejA）、100mg.L-1赤霉素（GA3）和10umoI.L-1脫落酸（ABA）處理24h后取樣，每次取材進行3次生物學重復，測量不同激素處理下BpAMT基因表達量的變化情況。

1.2.2.5不同非生物脅迫下表達模式分析選擇長勢一致的白樺盆栽苗，分別用50mmoI.L-1氯化鎘（CdC12）、10%（W/V）PEG6000和4℃環境模擬重金屬、干旱和低溫脅迫，處理24h后取樣，每次取材進行3次生物學重復，測量不同非生物脅迫下BpAMT基因表達量的變化情況。

2結果與分析

2.1BpAMT家族成員鑒定及基本特征分析

從白樺基因組中篩選鑒定了9個BpAMT基因，分別編號為BpAMT1.1～1.4、BpAMT2.1～2.5（表2）。對BpAMT蛋白理化性質分析表明：氨基酸殘基數范圍為384～522，分子量范圍為41.64～57.46kD，蛋白質等電點范圍為4.61～8.16。BpAMT蛋白親水系數均為正值，均為疏水性蛋白。此外，亞細胞定位結果顯示：BpAMT主要定位于膜結構上，多分布在葉綠體、質膜與內質網上，這可能與BpAMT蛋白的跨膜轉運功能有關。BpAMT基因成功定位于第3、5、8、13和14條染色體上，其中，第5號染色體上分布基因最多，有3個基因，且均分布在染色體下端。第8號和13號染色體上基因分布最少，均有1個基因。BpAMT2.1和BpAMT2.2在第14號染色體上的位置接近，并且二者的序列長度和基因結構相似，可能是BpAMT中的串聯復制基因。

2.2BpAMT系統發育分析

如圖1所示，將白樺BpAMT與擬南芥、柑橘、百脈根、楊樹（Populus trichocarpa Torr.＆Gray）、茶樹（Camellia sinensis L）和杜梨（Pyrusbetulifolia Bunge.）AMT氨基酸序列構建進化樹。結果顯示：BpAMT家族分為BpAMT1與BpAMT2兩個進化支，在9個BpAMT基因中，其中4個屬于BpAMT1亞家族，5個屬于BpAMT2亞家族。其中BpAMT1.4與BpAMT1亞家族中其余3名成員親緣關系較遠，與杜梨PbAMT1.3、PbAMT1.5及楊樹PtrAMT1.6聚類在一起。白樺BpAMT與楊樹PtrAMT聚類最多，親緣關系較近。

2.3基因結構與保守基序分析

為了了解BpAMT基因的序列特征，對其基因結構及保守基序進行分析。圖2A表明：BpAMT1.1～1.3均含有—個1個外顯子，無內含子；BpAMT1.4含有4個外顯子與3個內含子；BpAMT2基因序列包含3～6個外顯子與3～5個內含子，且具有未翻譯區結構。

BpAMTs保守基序見圖2B，BpAMT兩個亞家族中均存在motif 4、5、6、7、9這5種保守基序。BpAMT2亞家族成員氨基酸序列中含有特定識別基序motif3，除BpAMT1.4外，BpAMT1亞家族成員氨基酸序列中含有特定識別基序motif10，motif 7在兩個亞家族中都存在，但是位置有很大差異，motif 7在BpAMT1的5端，而在BpAMT2的中段。BpAMT的保守性較高，同一個亞家族的BpAMT蛋白motif分布較相似，這些保守motif的存在保證了家族成員在轉運銨鹽中發揮穩定的作用。

2.4順式作用元件分析

提取BpAMT基因編碼區上游2000bp的核苷酸序列，根據BpAMT基因家族的性質，去除一般性轉錄調控元件和功能未知元件，圖3表明：發揮功能的元件主要分為3類：逆境脅迫響應元件、光響應元件及植物激素響應元件，從中選取了10種重要的順式元件進行可視化。

除BpAMT1.3外，其余BpAMT啟動子區具有1～2個逆境響應元件，包括TC-rich repeats元件、響應干旱脅迫的MYB元件以及響應低溫脅迫的LTR元件，說明這些成員與逆境應答密切相關。BpAMT啟動子區的光反應元件主要為G-box元件，除BpAMT1.2與BpAMT2.5不包含光反應元件外，其余BpAMT啟動子區具有1～3個光響應元件，BpAMT2.3啟動子區具有參與晝夜節律調控的元件。BpAMT啟動子區激素響應元件種類較多，主要有參與脫落酸反應的ARBE元件、響應生長素的TGA-box元件、參與水楊酸反應相關的TGA-motf元件以及響應赤霉素的TATC-box元件，表明BpAMT可能受到各種不同激素的調控。以上結果表明，BpAMT可能與逆境應答、激素信號轉導和生長發育過程密切相關。

2.5BpAMT的組織部位表達模式分析

如圖4所示，BpAMT家族基因在組培苗和盆栽幼苗根、莖和葉中的表達趨勢相同，均呈現葉>根>莖趨勢，其中，在盆栽苗和組培苗莖和葉部位BpAMT1.1的表達量最高，分別為153.05和377.41、267.88和253.06；在盆栽苗和組培苗根、莖、葉中BpAMT1.3的表達量均最低，分別為9.35、2.14、1和1、12.18、2.19。

2.6不同氮素條件下BpAMT的表達模式分析

如圖5所示，BpAMT家族基因在硝態氮和銨態氮處理后的表達趨勢不同。在去除培養基中無機氮源（CKO）的條件下，除BpAMT2.3之外的BpAMT表達量均呈上調趨勢；在KN03與NH4CI處理下，BpAMT1.1和2.1表達量均呈上調趨勢，其余BpAMT在KN03處理下均呈下調趨勢，其余BpAMT1與BpAMT2在NH4CI處理下呈現相反的變化趨勢，其中，BpAMT2.1表達量在CKO、3mmoI.L-1 KN03.0.1mmoI.L-1NH4CI與3mmoI.L-1NH4CI處理下均呈上調趨勢，表達量分別為對照組的19、58、50和18倍。BpAMT1.3和1.4的表達量在不同氮素條件下的表達都比較低，這可能與其較大的基因家族有關系，表明家族基因之間存在功能冗余。

2.7BpAMT的日變化表達模式分析

如圖6所示，BpAMT1.1、1.3、2.1、2.2和2.3表達量在3：00-15：00時段呈上升趨勢，在18：00-0：00時段呈下降趨勢，BpAMT1.4和2.4的日變化規律與之相反。不同基因表達量達峰值的時間不同，BpAMT1.1和1.3表達量在18： 00達到峰值，BpAMT2.1、2.2和2.3表達量在15： 00達到峰值，BpAMT1.4表達量在00：00達到峰值，BpAMT2.4表達量在3：00達到峰值。

2.8BpAMT在激素處理下的表達模式分析

如圖7所示，BpAMTs在MejA、GA3和ABA處理下呈現不同的表達特征。經MejA處理后，除BpAMT1.3和BpAMT2.1外，其余7個BpAMT的表達量上調，其中，BpAMT1.4表達量在根部上調最明顯，為對照組的4.18倍，BpAMT2.7表達量在根部下調最明顯，為對照組的0.14倍。經ABA處理后，BpAMT1.1、2.1、2.2和2.5的表達量上調，其余5個BpAMT的表達量下調，其中，BpAMT2.7表達量在Ⅱ十片中上調最明顯，為對照組的6.01倍，BpAMT1.3表達量在莖部下調最明顯，為對照組的0.18倍。經GA3處理后，BpAMT1.1、2.2和2.4的表達量上調，BpAMT2.5的表達量下調，其余5個BpAMT的表達量沒有顯著變化，其中，BpAMT2.2表達量在根部上調最明顯，為對照組的6.17倍，BpAMT2.5表達量在葉片下調最明顯，為對照組的0.41倍。在MejA、GA3和ABA處理下，BpAMT1.1和2.2在葉、莖和根中均呈現上調表達趨勢。以上結果表明，BpAMT受多種激素的誘導表達，但對不同激素的響應程度與響應部位存在差異。

2.9BpAMT在非生物脅迫下的表達模式分析

如圖8所示，BpAMT在低溫、干旱和氯化鎘處理下呈現不同的表達特征。經低溫處理后，BpAMT1.2、7.4、2.2、2.4和2.5的表達量上調，BpAMT1.1和2.3的表達量下調，其中，BpAMT2.4在莖部上調最明顯，為對照組的12.25倍，BpAMT1.1在根中下調最明顯，為對照組0.13倍。經干旱處理后，BpAMT1.1、1.4、2.1和2.3的表達量上調，BpAMT1.2、1.3、2.2和2.5的表達量下調，其中，BpAMT1.4在莖部上調最明顯，為對照組的9.97倍，BpAMT2.5在莖部下調最明顯，為對照組的0.13倍。經氯化鎘處理后，BpAMT2.1和2.4的表達量上調，BpAMT2.2和2.3的表達量沒有顯著變化，其余BpAMT的表達量下調，其中，BpAMT2.4的表達量在莖中上調最明顯，為對照組的9.74倍，BpAMT1.3在莖中下調最明顯，為對照組的0.09倍。在低溫、干旱和氯化鎘處理下，BpAMT2.1在葉、莖和根3個組織部位中均呈現上調表達趨勢。以上結果表明，BpAMTs在不同非生物脅迫中的表達情況存在差異，推測在逆境中發揮不同的作用。

3討論

銨是植物根系吸收的經濟有效的一種氮素形式，AMT介導的高親和力銨跨質膜運輸是植物根系吸收銨的主要途徑。近年來，有關植物吸收和轉運銨態氮的分子機制有了較大突破，特別是隨著高通量測序技術的發展，擬南芥、谷子（Setariaitalica Beauv.）、玉米（Zea maysL_）及甘蔗（Saccharum officinarum L-）等植物的AMT遺傳信息逐步被發掘。

白樺基因組數據的公布為系統解析BpAMT家族成員提供了可能。因此，本論文基于白樺基因組和本研究室獲得的轉錄組數據，共篩選了9個具有完整Ammonium-transp superfamily結構域的BpAMTs，與已報道的植物AMT家族分為AMT1和AMT2兩個亞家族一致，9個BpAMTs也分為兩類，其中，4個屬于BpAMT1亞家族，5個屬于BpAMT2亞家族。

BpAMT2亞家族成員的氨基酸序列中均具有特定識別基序motif 3，保守基序的數量和位置相同，其基因結構中外顯子數目在3～6個之間，這與葡萄（Vitis vinifera L．）、水稻與百脈根等植物AMT2亞家族成員的報道一致; BpAMT1亞家族成員BpAMT1.1～1.3的氨基酸序列中保守基序的數量和位置相同，均含有特定識別基序motif10，基因結構中不含內含子，這也與大麥（Hordeum vulgare Ll）和楊樹等植物中大多數AMT1基因不含內含子的報道一致。BpAMT1.4基因結構中包含3個內含子，其氨基酸序列中缺失motif8和BpAMT1亞家族特定識別序列motif10，但其它保守基序的數目和位置都與BpAMT1.1～1.3相同；進化關系分析發現，BpAMT1.4與BpAMT1.1～1.3定位在同一分支上，故將其歸類于BpAMT1亞家族。BpAMT1.4氨基酸序列中缺失motif10可能與其結構演化過程中內含子的獲得有關，同時推測其可能參與特殊的銨轉運機制。

基因家族的進化過程中會出現基因復制、擴展、丟失和漂移等事件，BpAMTs也出現了基因片段復制事件，且不均勻分布于5條染色體上。由此推測，為了適應不同生境下的氮素種類及供給量，白樺在進化過程中可能通過擴展BpAMT基因家族來適應環境。啟動子順式式作用元件分析顯示：BpAMTs含有多個脅迫響應元件、激素響應以及光反應元件等，表明BpAMTs基因潛在的重要功能。同一亞家族內成員含有的元件類型和數量也各不相同，表明BpAMTs的表達調控方式具有一定的特異性。

植物AMT基因的表達具有組織特異性，如擬南芥在根中表達最高，在莖中表達最高，AtAMT1.4在花粉中專一性表達。同樣，在2種白樺材料中對BpAMTs的組織部位表達模式進行了驗證，不同組織部位的BpAMTs表達趨勢均為葉>根>莖。由此推測，BpAMTs基因表達主要受葉片中系統氮態信號以及根系中局部銨態信號的控制。在響應光照的日變化中，菜心BcAMTs基因表達量在6：00-12： 00為上升趨勢，15：00-00：00呈下降趨勢，在中午12：00時表達量達到峰值。同樣，BpAMT1.1、1.3與BpAMT2.1～2.3的在同一日周期內的表達量也有相似的趨勢，而BpAMT1.4、BpAMT2.4日變化趨勢與之相反，表明在光照逐漸減少的情況下，白樺通過提高BpAMT1.4、BpAMT2.4基因的表達，維持植物夜間的銨根離子吸收。由此可見，BpAMTs表達受日變化光周期的影響，而銨根離子吸收速率是否具有日變化趨勢還需進一步驗證。

一般情況下，缺氮或低氮條件對銨根離子的吸收有促進作用，不同的氮源對銨根離子的吸收也有影響，硝酸根作為氮代謝過程中氮元素吸收同化的源頭，可以在酶促反應下合成銨根離子，作為銨根離子轉運基因，BpAMTs表達的規律性有待明確。BpAMTs在不同氮素處理下呈現不同的表達特征。在缺氮條件下，除BpAMT2.3外，其余BpAMTs表達量均上升，這與柑橘、地錢（Marchantiapolymorpha L-）及小麥[29]在缺氮后AMT基因表達趨勢相似；在高濃度單一硝態氮為氮源的條件下，BpAMT2.1、1.1與2.5表達量顯著提高，推測這可能與高濃度單一硝態氮對懸浮細胞產生了脅迫有關系，使之趨向于吸收耗能更低的銨根離子。

研究表明，氮素形態影響植物體內部分激素的合成和運輸，同時通過外施激素也可以增加植物的氮素利用率。外源激素是影響AMT基因表達的重要因素，MejA和ABA處理杜梨后，發現PbAMT1.5的表達顯著上調; GA3和NAA處理毛竹后，多個PeAMTs顯著上調，PeAMT4顯著下調。BpAMT對激素的響應存在差異，BpAMT1.1、2.1、2.2、2.4和2.5對MejA、GA3和ABA處理均具有敏感性，其中，BpAMT1.1和2.2在葉．莖和根中均呈現上調表達趨勢，且在根部響應最強烈，推測白樺根部銨根離子的吸收過程與激素互相作用，共同調節白樺的根系發育。

非生物脅迫是影響植物銨根吸收轉運的重要因素。干旱脅迫下楸子（Malus prunifolia Borkh.）MpAMT1.2和4.2的表達顯著上調；茶樹在鹽脅迫下CsAMT1.3b和3.1表達顯著下調，CsAMT1.1a、2.1a和3.3表達顯著上調。BpAMT對非生物脅迫的響應存在差異，BpAMT1.1、1.2、2.1和2.5對低溫、干旱和鎘脅迫處理均具有敏感性，其中，BpAMT2.1在葉、莖和根3個組織部位中均呈現上調表達趨勢，且在莖部響應最強烈，可能由于脅迫處理改變了不同組織部位對銨態氮的利用度，打破了銨根離子在根與莖之間運輸過程的動態平衡，導致BpAMT在莖部的表達改變。鎘脅迫下的下調基因數量最多，可能因為NH4+與Gd2+同為陽離子，白樺通過抑制銨根離子的吸收降低植物對Cd2+的吸收，對植物本身起保護作用。由此認為，BpAMT基因可能通過在逆境環境中調節銨態氮的吸收與轉運，從而保證氮代謝的穩定性。以上結果為白樺氮素吸收代謝與激素以及非生物逆境之間的互作研究提供了參考思路。

4結論

從白樺基因組數據庫中鑒定了9個BpAMT家族成員，定位到白樺5條染色體上，根據進化關系和結構特征分為2個亞家族。BpAMT基因表達具有組織部位特異性，受日變化、不同氮素、激素和非生物脅迫等影響，其中，BpAMT1.1與BpAMT2.1響應較強。以上結果為BpAMT家族成員的功能研究提供了有價值的信息和可靠的候選基因。