杜仲種子內生微生物群落組成及生態功能分析

張青青 董醇波 邵秋雨 陸瑩霞 董旋 梁宗琦 韓燕峰

關鍵詞：高通量測序；可培養法；多樣性；生態功能

植物內生菌（Endophytes）是指某一階段或所有階段生活在健康植物的組織或器官中，與植物建立特殊的相互關系，并不會對宿主引起明顯病害的一類微生物。據報道，植物內生菌作為一種新興微生物資源，對植物的生長和健康至關重要，且在醫學、農業、工業等領域具有潛在的應用前景。

種子是植物的重要繁殖器官，是遺傳信息的保存和傳遞者，其內攜帶豐富多樣的微生物。種子內生菌主要包括多種真菌和細菌，能從不同環境（如空氣、水、昆蟲）通過水平傳播獲得，同時也能從母株通過垂直傳播獲得，并代代相傳。種子中常見真菌屬有鏈格孢屬（Alternaria）、枝孢霉屬、青霉屬等，常見細菌屬有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、泛菌屬（Pantoea）等；而種子內生菌的群落組成和多樣性常受多種生物與非生物因素的影響，如植物品種、基因型、種子成熟過程、地理位置及病原體入侵等。研究表明，種子作為微生物的載體會因自身及特殊的生存環境在內部形成獨特的微生物群落，這些特殊類群可為宿主植物提供保護功能。當種子內生菌作為益生微生物資源，能通過直接（如固氮、溶磷和產生植物激素）或間接作用（對抗植物病害、提高植物抗逆性和生物與非生物的耐受性）促進種子的萌發和幼苗的建立

除此之外，種子相關內生菌可以產生與宿主次級代謝成分相同或者相似的化合物，它們能調控宿主植物的次級代謝，促進有效成分的合成與積累。陳海敏等發現，種子中的草莖點霉（Phoma herbarum）D603可以有效促進丹參根部丹參酮類成分，尤其是丹參酮IIA的合成與積累。然而，并非所有的微生物都是有益的，種子攜帶的一些病原菌會降低種子活力、抑制種子萌發和引起植物病害，進而對糧食作物和林木安全生產造成威脅。因此，了解種子相關的微生物群落組成和功能可以幫助我們了解種子健康，防止有害微生物的影響，并充分利用與種子相關的有益微生物。

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是我國特有的藥用和經濟樹種，作為藥材，具有降壓、增強免疫力、降血糖等藥理作用；杜仲果、葉、皮中均含有豐富的杜仲橡膠，且杜仲果實富含油脂，是開發保健品、功能食品、高檔食用油的優質原料。前期研究發現，杜仲的不同組織中都伴有豐富的內生微生物，并且這些微生物與宿主健康、生產力和藥用成分的合成和積累有關。楊娟等研究表明，杜仲樹皮中的某些真菌類群與樹皮的藥理活性成分成正相關。Dong等通過探究杜仲樹皮中細菌群落組成和核心微生物群的功能，發現細菌菌群中的大部分核心菌群與樹皮的藥理活性成分相關。然而，迄今為止，大多數相關研究通常集中在根際、莖、葉，對于杜仲種子相關微生物的組成結構以及生態功能的了解仍然知之甚少。因此，本研究結合分離培養法和高通量測序技術對杜仲種子內生真菌和細菌群落組成結構和多樣性進行探究。同時，利用FUNGuild和FAPROTAX平臺進行功能注釋。高通量測序技術能更加全面的揭示杜仲種子內生菌群落組成和多樣性，可培養法可以分離獲得實體菌株，這2種方法的結合能全面認識杜仲種子微生物，豐富杜仲相關微生物資源，并為今后杜仲種子內生菌的功能研究以及杜仲的高效栽培提供參考依據。

1材料與方法

1.1種子處理

杜仲果實采自陜西省漢中市寧強縣大安鎮。樣品編號后封存在自封袋中，放人4℃冰箱保存備用。將杜仲果實剝去果皮，稱取5g種子置于燒杯中，依次用無菌蒸餾水對杜仲種子進行沖洗，75%的酒精消毒30s，5%的次氯酸鈉進行消毒3～5min，75%酒精消毒30s，最后使用無菌蒸餾水沖洗5～6遍，在無菌條件下晾干，以備用。將最后一次沖洗種子的無菌水涂布到PDA培養基和LB培養基上作為對照實驗，以保證表面滅菌徹底。

1.2分離培養

1.2.1內生真菌的分離純化真菌的分離培養基分別使用PDA培養基、MS培養基。分離方法采用（1）組織塊分離法：將一部分表面滅菌好的種子放人研缽中碾碎，直接放在PDA培養基和MS培養基中；另一部分使用無菌刀劃開幾個小口，將其接種到PDA培養基、MS培養基，并保證切口直接接觸培養基，各設置3個重復；（2）稀釋涂布平板法：取表面滅菌后的種子樣品5g，放在加有5mL的無菌蒸餾水的無菌研缽中充分研磨，裝入離心管中充分搖勻，并稀釋成10-1、10-2、10-3懸液，分別吸取100、200、300UL稀釋液涂布于PDA培養基中，每個處理3個重復，置于25～28℃下培養5～7d。待菌絲長出，用接菌針從邊緣挑取菌絲移至PDA平板，采用菌絲頂端純化法對分離出的菌種逐步進行純化。

1.2.2內生細菌的分離純化細菌的分離培養基使用LB、NA、牛肉膏蛋白胨培養基。分離方法采用稀釋涂布平板法：取表面滅菌后的樣品5g，放在加有5mL的無菌蒸餾水的無菌研缽中充分研磨，裝入離心管中充分搖勻，將其稀釋成10-1、10-2、10-3懸液，并分別吸取100、200、300μL稀釋液涂布于LB、NA、牛肉膏蛋白胨培養基中，各設置3個重復，置于25～28℃下培養4～5d。根據菌落形態（大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度等），隨機挑取具有差異的代表性菌株進行平板劃線法逐步純化。

1.3分子鑒定

1.3.1DNA的提取、PCR擴增反應參考真菌基因組DNA提取試劑盒（北京白泰克生物技術有限公司）和細菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）進行真菌和細菌的DNA提取。細菌16SrDNA引物：27F（5-AGAGTTTGATGCTGGCTGAG-3）和1 492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），真菌ITS引物：ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 7）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）.PCR反應體系（ 25 pL）：引物ITS1和ITS4均為1 UL，2×Taq PCR Master-mix為12.5UL， ddH20 8.5pL，細菌／真菌DNA 2 pL。細菌PCR反應條件：95℃預變性5min，92℃變性30s，50℃退火30s，68℃延伸2min，共35個循環，78℃延伸8min。真菌PCR反應條件：94℃預變陛5min，1個循環，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35個循環，72℃延伸10min。分別取擴增后的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至昆明碩擎生物科技有限公司進行測序。

1.3.2序列數據分析將獲得的待鑒定的ITS和16SrDNA擴增序列，經手工校對后登陸NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行blast比對，得到相似度最高的序列，進行種屬鑒定。

1.4高通量測序

1.4.1總DNA提取、PGR擴增及llluminaMiSeq測序選取顆粒大小一致的飽滿種子，經表面滅菌后（同上1.1），分別用液氮進行充分研磨，并裝入無菌離心管中，樣本共設置3個重復。處理后的所有樣本均置于-80℃冰箱保存，用于總DNA提取和高通量測序。總DNA的提取按總DNA提取試劑盒（FastDNA⑩SPIN Kit for Soil）的說明書操作程序進行。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。PCR擴增分別選用ITS1區真菌引物（ITSIF，5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3和ITS2R，5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）和細菌引物（799F，5-AACMGGATTAGATACCCKG-3和1193R， 5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3）。采用20mL的PCR反應體系：5×Buffer4UL，2.5mmoI.L-1 dNTPs 2UL，每個正向和反向引物（5mol-1）0.8UL，rTaq多聚酶0.4pL，BSA 0.2UL，模板DNA10ng，而后補ddH20至20UL。真菌PCR擴增反應參數：95℃3min；95℃30s，退火溫度55℃30s，72℃45s，35個循環；72℃10min，10℃直至用戶停止。細菌PCR擴增反應條仵：95℃3min；95℃15s，退火溫度55℃30s，72℃45s，13個循環；72℃10min，4℃保存。PCR儀：ABI GeneAmp9700型。得到的PCR產物經上海美吉生物醫藥科技有限公司（www.majorbio.com）lllumina Miseq平臺進行高通量測序。

1.4.2原始數據處理使用Qiime2軟件中的DADA2插件對所有樣品的全部原始序列進行質控、去噪、拼接及去嵌合體處理，形成OTU（operational taxonomic unit）。選取OTU的代表性序列于Unite（Release7.0，http：//unite.ut.ee/index.php）數據庫進行比對，獲得每個OTU的物種注釋信息。基于物種注釋信息，去除注釋為葉綠體、線粒體和不能注釋到界（kingdom）水平的OTU及其包含的序列，最終形成數據均一化的OTU及其他分類水平物種豐度譜。

1.5多樣性分析

使用Qiime2和Excel軟件計算各樣本Alpha多樣性指數，包括香農．維納指數（Shannondiversity index）、辛普森指數（Simpson diversityindex）．chaol指數、ACE指數等。

1.6生態功能注釋

真菌功能類群分析：采用FUNGuild（http：//fungu．ld.org）數據庫對真菌群落進行功能注釋，置信度選擇可能（probable）和很可能（highlyprobable）。

細菌功能類群分析：采用FAPROTAX數據庫（http：//www.ehbio.com/lmageGP/index.php/Ho-me/lndex/FAPROTAX.html）對細菌群落進行功臺旨注釋。

2結果與分析

2.1杜仲種子微生物群落組成

傳統培養法獲得的杜仲種子微生物群落組成（表1）表明：采用分離培養法共獲得真菌40株，初步鑒定為3門、5綱、8目、10科、11屬、18種。在門水平，杜仲種子中可培養真菌歸為3個門：子囊菌門（Ascomycota）（87.50%）、擔子菌門（10%）、毛霉門（Mucoromycota）（2.50%），其中，子囊菌門（Ascomycota）為主要優勢菌門，其次為擔子菌門。在綱水平，散囊菌綱（Eurotiomycetes）為主要優勢菌綱，占比52.50%；其決為座囊菌綱（Dothideomycetes）（22.50%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）（12.50%）、傘菌綱（Agaricomycetes）（10%）以及占比為2.50%的毛霉綱（Mucoromycetes）。在屬水平，以曲霉屬（Aspergillus）（30%）、鏈格孢屬（Alternaria）（12.50%）為主要優勢屬，隨后是占比均為10%的青霉屬（Penicillium）、籃狀菌屬（Talaromyces）、煙管菌屬（Bjerkandera），枝孢霉屬（Cladosporium）（7.50%）和節菱孢菌屬

（Arthrinium）（7.50%）較為常見。在種水平上，煙曲霉（Aspergillus fumigatus）（12.50%）、交鏈格孢（Alternaria alternata）（10%）、艾米斯托克藍狀菌（Talaromyces amestolkiae）（10%）占據一定優勢。

杜仲種子中分離到內生細菌共142株，隸屬于1門（厚壁菌門（Firmicutes））1綱（芽孢桿菌綱（Bacilli））1目（芽孢桿菌目（Bacillales））5科6屬（含1個未定屬）11種（含2個未定種）。6個屬中，土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus）以47.18%的相對多度占據優勢地位，其次為類芽孢桿菌科（ Paenibacillaceae）中一未定屬

（21.83%）、Peribacillus（12.67%）和Cytobacillus（11.27%）。在種水平，森林土壤芽孢桿菌（Solibacillus silvestris）（37.32%）在整個細菌菌群中占有絕對優勢，類芽孢桿菌科（Paenibacillaceae）中一未定屬（21.83%）、堅強芽孢桿菌（Cytobacillus firmus）（9.86%）和一種土壤芽孢桿菌（Solibacillus sp.）（9.86%）

次之。此外，Peribacillushuizhouensis（7.04%）和Peribacillussimplex（5.63%）也占據較高比例。

高通量測序獲得的杜仲種子微生物群落組成：對杜仲種子內生真菌和細菌測序獲得平均有效序列分別為64 368條、40121條，平均長度為234、376bp。杜仲種子內生真菌歸為141個OTUs，包括6門、15綱、38目、76科、101屬。在門水平，內生真菌肅屬于子囊菌門（ Ascomycota）、擔子菌門、鞭毛菌門（Mortierellomycota） 、羅茲菌門（Rozellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）和未分類真菌6大類，其中，子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）為主要優勢門，分別占比47.56%和46.91%；在屬水平，主要包括Apiotrichum、德巴利氏酵母屬15個優勢屬，其中Apiotrichum（31.28%）和德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）（26.07%）占有絕對優勢，為主要優勢屬（圖1a）。其余優勢屬如Leucosporidium、Kernia、青霉屬（Penicillium）等總占比為30.04%。常見屬如鏈格孢屬（Alternaria）（0.87%）也占據較高比例。

杜仲種子內生細菌歸為442個OTUs，包括24門、46綱、117目、193科、313屬。在門水平，內生細菌隸屬于變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）．放線菌門（Actinobacteriota）和藍細菌（Cyanobacteria）等24大類，其中，優勢門主要為變形菌門（ Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），分別占比52.49%和17.22%；隨后為擬桿菌門（Bacteroidota）（10.72%）、放線菌門（Actinobacteriota）（10.55%）；在綱水平，以Y-變形菌綱（Gammaproteobacteria）（33.68%），（18.81%）為優勢綱；在屬水平，所有類群主要歸為假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、固氮弧菌屬（Azoarcus）等13個優勢屬，主要優勢類群為假單胞菌屬（Pseudomonas）（16.66%），其次為乳桿菌屬（Lactobacillus）（9.68%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（8.22%）（圖1b）。

綜上表明，與傳統培養法相比，高通量測序技術能獲得更多種類和數量的杜仲種子內生真菌和細菌。

從門水平上分析，2種方法獲得的優勢真菌都主要集中在子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota），但其占比不同；高通量測序獲得的優勢細菌主要集中在變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），而可培養法主要分離到厚壁菌門（Firmicutes）的細菌。而從屬水平上分析發現，高通量獲得的菌株，如優勢真菌青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢霉屬（Cladosporium）可通過可培養法獲得，并同樣占據優勢地位（表1和圖1）。另外，以上結果還可看出，高通量測序法獲得的大部分菌株都屬于未被培養的菌株。因此，2種方法的結合能更加全面的揭示杜仲相關內生菌的組成和結構。

2.2杜仲種子微生物多樣性

在a多樣性指數中，Margalef指數、Chao1和ACE指數表示微生物群落的豐富度，值越大，豐富度越高。Shannon和Simpson指數表示微生物群落的多樣性程度，Shannon指數值越大，多樣性越高，而Simpson指數值越小，多樣性越大。在97%相似性下，分析杜仲種子內生真菌和內生細菌的多樣性指數（表2）。a多樣性指數分析結果表明，與傳統培養法相比，高通量測序技術得到的多樣性指數Shannon、高通量測序技術能更完整的展現出杜仲種子中微生物群落的豐富度和多樣性。

2.3杜仲種子微生物群功能分析

使用FUNGuilds平臺對杜仲種子內真菌類群的營養型和生態功能類群進行分析，其中，110個OTUs被成功注釋，營養型包括腐生型（Saprotroph）（950TUs，82.97%）、致病-腐生-共生型（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）（18 0TUs，6.10%）、致病型（Pathotroph）（12 0TUs，2.41%）、致病．腐生型（Pathotroph-Saprotroph）（7 0TUs，6.60%）、腐生-共生型（Saprotroph-Symbiotroph）（6 0TUs，0.63%）、共生型（Symbiotroph）（4 0TUs，0.34%）、致病-共生型（Pathotroph-Symbiotroph）（3 0TUs，0.83%）、致病-腐生-共生型（Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph）（1 0TU，0.11%）8大類。除未定類群（unknow），所有真菌類群主要涉及到未定義腐生茵（Undefined Saprotroph）（48 0TUs，33.83%）、植物病原菌（PlantPathogen）（5 0TUs，0.49%）、動物病原菌（Animal Pathogen）（5 0TUs，1.28%）、木質腐生菌（Wood Saprotroph）（4 0TUs，

0.45%）、真菌寄生菌（Fungal Parasite）（20TUs，0.27%）、糞生真菌（Dung Saprotroph） （2 0TUs，0.21%）、叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhizal fungi）（2OTUs，0.06%）、土壤腐生菌（Soil Saprotroph）（1 0TU，31.28%）、地衣（Lichenized fungi）（1 0TU，0.16%）、外生菌根（Ectomycorrhizalfungi）（1 0TU，0.07%）10類生態功能類群。此外，還包括多種混合功能類群如真菌寄生．未定義腐生菌（Fungal Parasite-UndefinedSaprotroph）（4 0TUs，1.51%）、內生菌-地衣腐生菌-土壤腐生菌-未定義腐生菌（ Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-UndefinedSaprotroph）（4 0TUs．0.48%）、內生菌-植物病原菌（Endophyte-Plant Pathogen）（2 0TUs，0.21%）等21類。31個OTUs在FUNGuilds數據庫中未能注釋到對應功能。整體來看，在OTU水平上杜仲種子內的真菌功能群主要集中于未定義腐生菌（48 0TUs）、植物病原菌（5 0TUs）、動物病原菌（5 0TUs）（圖2a）。在屬水平，物種豐度占比最高的Apiotrichum（31.28%）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）（26.07%）分別屬于腐生型中的土壤腐生菌和未定義腐生菌。此外，一些常見屬在生態系統中扮演多重角色，如枝孢霉屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria），既屬于動物病原菌，又屬于內生菌、植物病原菌、腐生菌。

使用FAPROTAX平臺對細菌功能分類注釋（圖2b），選取總豐度前50的功能，結果發現，杜仲種子中的細菌群落生態功能歸為化能異氧（chemoheterotrophy）、有氧化能異養（aerobicchemoheterotrophy）、

發酵（fermentation）、硝酸還原（nitrate reduction）、亞硝酸呼吸（nitrate respiration）、尿素分解（ureolysis）、動物寄生生物或共生體（animal parasites orsymbionts）、芳香族化合物降解（aromaticcompound degradation）、固氮作用（nitrogenfixation）、人類病原菌（human pathogens）、植物病原菌（plant pathogen）等44個功能類群，其中，細菌功能主要集中于化能異氧（31.96%）、有氧化能異養（23%）、發酵（8.79%）。部分集中于硝酸還原（4.50%）、亞硝酸呼吸（3.06%）、氮呼吸（3.06%）、尿素分解（2.63%）、動物寄生生物或共生體（2.51%）、芳香族化合物降解（1.88%）、固氮作用（1.61%）、人類病原菌（1.38%）、植物病原菌（1.03%）9類。少部分屬于暗氫氧化（dark hydrogen oxidation）（0.95%）、亞硝酸鹽氨化（0.92%）等32個功能類群，總占比為14.60%。

3討論

種子微生物是定殖于種子和幼苗的第一個微生物群，這類微生物的組成和垂直傳播對種子質量、植物生長及次生代謝產物的合成至關重要。本研究通過對杜仲種子內生真菌和細菌進行分離培養，最終獲得真菌共40株，鑒定為3門11屬，主要優勢屬為曲霉屬（30%）、鏈格孢屬（12．50%）；內生細菌共142株，鑒定為1門6屬，以土壤芽孢桿菌屬（47.18%）為主要優勢屬。該結果與早前研究報道有相似之處，如鏈格孢屬被證實是植物種子中最常見的真菌屬。其次，與本課題組前期在杜仲樹皮中分離到的內生菌相比，種子中的內生菌種類和數量明顯降低，說明內生菌在同種植物不同器官中的分布存在差異。這可能是由于種子是受植物高度保護的封閉性器官，導致其內生菌的種類和數量比其他器官要少。由于自然環境中絕大多數微生物是不能被傳統培養方法所培養，常規分離培養方法和較單一培養基分離到的微生物并不能完整地反映杜仲種子中微生物的群落結構，而高通量測序結果分析能更全面的展現杜仲種子中微生物群落結構和多樣性。因此，本文以高通量測序結果對杜仲種子內生微生物多樣性和功能進行補充分析。

功能預測注釋到多種有益功能菌群。目前，報道指出，植物種子的內生細菌主要集中在變形菌門、厚壁菌門和放線菌門；而本研究也發現，變形菌門和厚壁菌門為杜仲種子中細菌的主要優勢門。在屬水平，細菌主要包括假單胞菌屬、乳桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、固氮弧菌屬等13個優勢屬，其中，假單胞菌屬（16.66%），乳桿菌屬（9.68%）和鞘氨醇單胞菌屬（8.22%）在整個細菌群落中占有絕對優勢。相關研究表明，假單胞菌和鞘氨醇單胞菌作為有益內生菌廣泛存在水稻、煙草、丹參等植物種子中，它們可以通過提高植物的固氮能力或啟動植物免疫系統、分泌抗生素以及抑制病原菌（與病原體競爭資源）來改善植物生產力和健康。如Pham等發現，固氮菌（Pseudomonasstutzeri）A15在溫室條件下能顯著促進水稻幼苗的生長，且該菌株的固氮效果優于普通化學氮肥。綠蚜假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）和Pseudomonas aurantiaca可以通過產生次級代謝產物促進植物生長。沈興亮等證實，Pseudomonasfluorescens能顯著提高茶樹的生長生理水平。Sphingomonas sp. cra20也被證明在干旱脅迫下能促進擬南芥根系的發育，并改變根際微生物群落結構。同時，Matsumoto等研究發現，Sphingomonasmelonis能在抗病水稻種子中積累、代代相傳，并通過產生鄰氨基苯甲酸（anthran．lic acid）使高感病品種產生抗病性。李曉君等報道，來自丹參根中的Pseudomonas sp.具有抗氧化和抗菌活性的作用。此外，生態功能注釋結果也顯示杜仲種子中的細菌功能大多集于潛在化能異氧、有氧化能異養、硝酸還原、氮呼吸、固氮作用。總之，杜仲種子中存在的多種潛在有益細菌在調節氮循環和對抗病原體中可能發揮一定的重要性作用。

在真菌中子囊菌門和擔子菌門為主要優勢門，其中，Apiotrichum（31.28%）和德巴利氏酵母屬（26.07%）為主要優勢屬。近期研究發現，Apiotrichum中的某些物種被認為能產生油脂類的次級代謝物，這可能與杜仲種子中富含大量的油脂類物質相關。如Apiotrichum porosum DSM27194被證實不僅能同化乙酸、丙酸、丁酸及其不同混合物以積累微生物油脂，還具有將木質纖維素水解產物中的多種碳源轉化為微生物油脂的能力。而德巴利氏酵母屬對灰霉病、炭疽病具有明顯的抑制作用。此外，生態功能注釋結果表明，在杜仲種子中多數真菌都屬于腐生型真菌（95 0TUs，82.97%），這些真菌被認為具有降解木質素、纖維素的能力，其可能參與凋落物的分解，幫助宿主吸收有機物和礦物質元素。凋落物的分解是森林生態系統化學循環的主要環節之一，對群落組成及分布具有重要作用。另外，部分真菌還被注釋為內生真菌、外生菌根真菌和叢枝菌根真菌，這些類群有較強的適應能力，可促進宿主植物生長、土壤養分吸收與利用、改善土壤環境微生物群落結構。如球囊菌門作為一類的重要的真菌門類，其成員包括一些分布廣泛、具有重要生態意義的真菌群一叢枝菌根真菌（AMF）。該類真菌不僅能改善磷營養、促進非生物和生物脅迫的耐受性，還能通過菌絲網絡和產生如球囊霉素等土壤顆粒結合物質并維持土壤的物理性質，在土壤聚集中發揮重要作用。因此，該類微生物可為種子在自然環境中的萌發提供各種有利條件。然而，除了注釋到的大量有益功能菌群，還有相當部分OTU被檢測為植物病原菌。如鏈格孢屬是多種植物病原菌，相關文獻報道稱這類真菌是引起小麥黑斑病、刺梨葉斑病的重要致病菌。因此，揭示種子相關微生物組成和功能是了解種子健康以及后續人為調整微生物菌群增強植物健康、提高作物產量和質量的先決條件。

4結論

本研究結果證實了杜仲種子中存在多種內生細菌和真菌，且功能注釋表明杜仲種子中攜帶多種有益功能菌和潛在致病菌。本研究不僅分離到節菱孢菌屬（引起大麥立枯病）、鏈格孢屬和黑團孢屬（引起刺梨葉斑病）等多種已被報道的植物病原菌，同時還獲得多株可能對植物生長及生防具有潛在作用的內生菌（如青霉屬、曲霉屬、枝孢霉屬和芽孢桿菌屬）。但這類微生物是否對杜仲植物生長及藥理活性成分的合成產生積極影響，還有待進一步研究。此外，高通量測序數據還可以幫助我們通過確定優勢目標菌株，然后針對目標菌株的特性選擇更為合適的培養基，從而最大限度地獲取更多的內生菌。因此，本研究結果將為今后杜仲種子內生菌的功能研究、杜仲的高效栽培以及生物防治提供參考信息。