新型冠狀病毒主蛋白酶天然產(chǎn)物抑制劑的篩選

師云凡 鞠壯 丁顯平

摘 要 ???：為尋找新型冠狀病毒主蛋白酶天然產(chǎn)物抑制劑，本文以SARS-CoV-2主蛋白酶為研究對象，通過計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選方法初步篩選出16個潛在抑制劑并進(jìn)行體外酶活測試.其中，野黃岑素對SARS-CoV-2主蛋白酶的IC ?50為（10.79 ± 2.116 ） μmol/L，沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制SARS-CoV-2主蛋白酶的IC ?50為（2.104 ± 0.346） μmol/L.最后，將兩種天然產(chǎn)物與主蛋白酶進(jìn)行分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)沒食子兒茶素沒食子酸酯和野黃岑素與新型冠狀病毒主蛋白酶結(jié)合時的復(fù)合物RMSD都在0.22 附近，說明兩個天然產(chǎn)物與新型冠狀病毒主蛋白酶結(jié)合較為穩(wěn)定，可以作為新型冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑或先導(dǎo)化合物.

關(guān)鍵詞 ：新型冠狀病毒主蛋白酶； 基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選； 沒食子兒茶素沒食子酸酯； 野黃岺素； 分子動力學(xué)模擬

中圖分類號 ：Q55；R914 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ：A DOI ： ?10.19907/j.0490-6756.2023.046001

收稿日期： ?2022-11-29

基金項(xiàng)目： ?四川省科技廳項(xiàng)目（2020JDS0039）

作者簡介： ??師云凡（1997-）， 女， 河南安陽人， 碩士研究生， 研究方向?yàn)橛?jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì).E-mail： 2811829836@qq.com

通訊作者： ?丁顯平.brainding@scu.edu.cn

Screening of natural product inhibitors targeting SARS-CoV-2 main protease

SHI Yun-Fan ?1，2， JU Zhuang ?1，2， DING Xian-Ping ?1，2

（1. College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China;

2. Joint Key Lab of Sichuan&Chongqing， Bioresource Res & Utilizat， Nanchuan 408400， China）

To screen natural product inhibitors targeting the SARS-CoV-2 main protease， this paper takes the main peoteases of SARS-Cov-2 as the research object， and 16 potential inhibitors were preliminarily screened by computer-aided drug screening method and tested for enzyme activity in vitro. Among them， the IC ?50 of scutellarin against SARS-CoV-2 main protease was （10.79 ± 2.116） μmol/L. The IC ?50 of （-）-Gallocatechin gallate against SARS-CoV-2 main protease was （2.104 ± 0.346） μmol/L. Finally， molecular dynamics simulations were performed on the two natural products and Mpro. It was found that the RMSD of the complexes of （-）-Gallocatechin gallate and Scutellarein with Mpro was around 0.22 ， indicating that the two natural products were stable in binding with Mpro and could be used as inhibitors or lead compounds of Mpro in SARS-CoV-2.

Mpro of SARS-CoV-2; Structure-based virtual screening; （-）-Gallocatechin gallate; Scutellarein； Molecular dynamic simulation

1 引 言

2019年12月底，中國武漢報告了一例不明原因肺炎病例，隨后世界上各個國家相繼報告類似癥狀病例，后經(jīng)研究表明，這是一種新型冠狀病毒導(dǎo)致的肺炎疫情，由于波及范圍之廣，因此被稱為大流行?。≒andemic） ?［1］. 測序結(jié)果顯示，新型冠狀病毒與SARS-CoV具有79%的序列一致性 ?［2］，由此被世界衛(wèi)生組織命名為SARS-CoV-2，由SARS-CoV-2引起的疾病稱為COVID-19 ?［3］.

新型冠狀病毒為 β 屬類冠狀病毒，具有較大的單股正鏈RNA，其基因組含約30000個核苷酸，從5′→3′端依次編碼兩種多聚蛋白和四種結(jié)構(gòu)蛋白，中間穿插編碼幾種輔助蛋白.兩種多聚蛋白被病毒中兩種主要的蛋白酶類胰凝乳蛋白酶和類木瓜蛋白酶切割成16種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中，類木瓜蛋白酶負(fù)責(zé)nsp1、nsp2和nsp3的切割，而類胰凝乳蛋白酶則負(fù)責(zé)后13種非結(jié)構(gòu)蛋白的切割，這16種非結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)揮各自作用從而促進(jìn)病毒的復(fù)制和表達(dá) ?［4-6］.

類胰凝乳蛋白酶也被稱作主蛋白酶，由于主蛋白酶在多種冠狀病毒中具有較強(qiáng)的保守性，并且目前沒有已知的人類半胱氨酸蛋白酶與其具有相似的切割位點(diǎn)，因而成為治療新型冠狀病毒的一個理想靶點(diǎn) ?［7，8］.

盡管目前全球已經(jīng)大范圍內(nèi)接種疫苗，但與該病毒導(dǎo)致的疾病相關(guān)問題還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有解決，許多抗體藥物被研發(fā)出來也被批準(zhǔn)但只能臨床應(yīng)用于危重癥患者，也有相關(guān)主蛋白酶抑制藥物如Paxlovid被FDA批準(zhǔn)用于新型冠狀病毒患者的治療，但正有研究表明單一藥物使用可能會造成病毒一些突變體耐藥，因此新的抑制劑需要被開發(fā)以應(yīng)對此次大流行病 ?［9，10］.

隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選與設(shè)計(jì)在當(dāng)下展現(xiàn)了極大的優(yōu)勢，在較短時間內(nèi)篩選出SARS-CoV-2主蛋白酶的有效抑制劑，將有利于后續(xù)藥物設(shè)計(jì)與改進(jìn)，為新型冠狀病毒的治療提供理論基礎(chǔ)和新思路.

2 材料與方法

2.1 材 料

文中所涉及的天然產(chǎn)物購買于上海陶術(shù)公司；新型冠狀病毒主蛋白酶抑制劑篩選試劑盒（增強(qiáng)型）、DMSO和全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自于碧云天.

2.2 方 法

2.2.1 SARS-CoV-2主蛋白酶變種序列和結(jié)構(gòu)比對 ?于NCBI上下載SARS-CoV-2突變株B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2、BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.3的核苷酸序列；利用ExPASy-Translate Tool將核苷酸序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列；在DNAMAN中載入氨基酸序列，點(diǎn)擊Sequence Alignment-Multiple Sequence Alignment，添加氨基酸序列，點(diǎn)擊Protein，進(jìn)行快速比對. 之后利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中的PairWise Structure Alignment模塊進(jìn)行了結(jié)構(gòu)對比評估野生型主蛋白酶的突變型主蛋白酶差異. 從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中下載7U29（K90R、2.088 ）、7TVX（P132H、2.094 ）和7RNK（2.1 ），利用Pymol處理蛋白，去除水分子和配體，進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)對比，突出展示活性口袋疊合構(gòu)象.

2.2.2 驗(yàn)證基于虛擬篩選模型可靠性 ?從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載6LU7結(jié)構(gòu)，用Pymol處理去除水分子和配體，保留蛋白單體，6W63結(jié)構(gòu)則是去除蛋白和水，保留X77配體結(jié)構(gòu)，再用Autodock Tool對蛋白進(jìn)行加氫計(jì)算電荷操作，接著對X77進(jìn)行探測可旋轉(zhuǎn)鍵操 作，之后均保存為pdbqt格式，以文獻(xiàn)所查閱新型冠狀病毒主蛋白酶活性氨基酸作為中心創(chuàng)建對接盒子，盒子具體信息為 center_ x ?= ?-10.351、center_ y ?= 13.549、center_ z ??= 69.904、 size_ x ?= 22.5、size_ y ?= 28.5和size_ z ?= 26.25. 利用Qvina2.1對X77和主蛋白酶進(jìn)行分子對接，所選用的exhaustiveness為24，對接模式為9種，能量差為3. 對接完成之后，利用Pymol對比X77打分最高的對接結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)，并計(jì)算其RMSD ?［11，12］.

2.2.3 天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)備 ?天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫（L6000）中的小分子配體是由陶術(shù)公司用Discovery Studio中的ligprep模塊經(jīng)OPLS3e力場優(yōu)化后的3D sdf格式，用Openbabel將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式備用.

2.2.4 類藥篩選 ?在基于結(jié)構(gòu)虛擬篩選之后，選出親和力小于-8 kcal/mol的化合物，合并其sdf結(jié)構(gòu)，將其提交到ADMETlab2.0網(wǎng)站上，根據(jù)100

2.2.5 FRET酶活抑制實(shí)驗(yàn) ?酶活抑制實(shí)驗(yàn)是根據(jù)試劑盒生產(chǎn)商說明書來執(zhí)行，初步篩選時化合物終濃度為20 μmol/L. 在添加底物之前，主蛋白酶和化合物先在30 ℃下孵育10 min來證抑制劑和蛋白的結(jié)合. 測IC ?50時化合物終濃度梯度分別為0.1、 1、 2、 5、 10、 20、 40、 80和160 μmol/L.

2.2.6 分子動力學(xué)模擬 ?利用gromacs中的pdb2gmx處理蛋白結(jié)構(gòu)，力場采用Amber14SB. 利用RESP2_ORCA.sh腳本生成小分子的RESP2電荷，之后利用Sobtop生成小分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) ?［14-16］；合并小分子和蛋白質(zhì)的拓?fù)湫畔ⅲ墒骟w盒子，水模型為TIP3P，添加SPC216水和四個鈉離子中和體系；能量最小化收斂在100 kJ/mol/nm內(nèi)；nvt位置限制性模擬設(shè)定為在100ps內(nèi)從0 K上升到300 K，隨后持續(xù)100 ps，溫度耦合方式為V-rescale；npt位置限制性模擬設(shè)定為500 ps，溫度耦合方式為V-rescale，壓力耦合方式為Berensden；最后放開位置限制，進(jìn)行正式模擬，溫度耦合方式不變，壓力耦合方式變?yōu)镻R ?［17-19］. 模擬完成之后，提取復(fù)合物的RMSD信息，分析天然產(chǎn)物與蛋白酶結(jié)合位點(diǎn).

3 結(jié) 果

3.1 ?SARS-CoV-2突變株主蛋白酶序列和結(jié)構(gòu)對比

首先，筆者對比了SARS-CoV-2突變株主蛋白酶的氨基酸序列，DNAMAN對比結(jié)果顯示突變株序列一致性為99.8%，如圖1所示，主蛋白酶只在兩個位置出現(xiàn)了突變，一個突變是K90R，另一個突變是P132H.

在Pymol中疊合三種突變蛋結(jié)構(gòu)，突出展示活性口袋，如圖2所示.活性口袋的微小差異幾乎可以忽略不計(jì).PairWise Structure Alignment結(jié)果顯示7RNK和7U29（K90R）之間的RMSD為0.5，TM-score為0.99，而這兩個評價值在7RNK和7TVX（P132H）之間分別為0.35和0.98. RMSD結(jié)果表征為兩個結(jié)構(gòu)之間的距離差異，而TM-score是用來檢測兩個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似性的指標(biāo)，主要考慮蛋白質(zhì)整體折疊情況. 總之，這些結(jié)果在一定程度上反映了SARS-CoV-2突變株主蛋白酶的保守性.

3.2 虛擬篩選模型可靠性評估

在正式虛擬篩選之前，我們利用Pymol對比了X77的晶體結(jié)構(gòu)和用Qvina2.1進(jìn)行對接的結(jié)構(gòu)，如圖3所示.晶體結(jié)構(gòu)和對接結(jié)構(gòu)之間的RMSD為1.263，相當(dāng)于一個原子大小.因此，基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選模型是準(zhǔn)確可靠的.

3.3 基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選和類藥篩選結(jié)果

在天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中，我們從3760種化合物中篩選出295種結(jié)合能小于-8 kcal/mol的化合物，接著我們利用ADMETlab2.0軟件根 據(jù)-4-5.15、PPB≤90%、CL≥5等條件從295種化合物中篩選出了16種天然產(chǎn)物，如表1所示.

3.4 酶活抑制結(jié)果分析

首先，我們測試了16種天然產(chǎn)物在終濃度為20 μmol/L時對新型冠狀病毒主蛋白酶的抑制效果，如圖4所示，（-）-Gallocatechin gallate與Scullarein在20 μmol/L時對新型冠狀病毒主蛋白酶的抑制率幾乎達(dá)到了100%，與陽性對照Ebeselen抑制率一致，而其它天然產(chǎn)物在20 μmol/L時對新型冠狀病毒主蛋白酶有一定抑制效果，盡管不太明顯，也無法排除這些天然產(chǎn)物在其它方面會對新型冠狀病毒產(chǎn)生一定抑制效果.

接著我們詳細(xì)測試了 （-）-Gallocatechin gallate、Scullarein兩者對新型冠狀病毒主蛋白酶的半數(shù)抑制濃度IC ?50，數(shù)據(jù)經(jīng)Graphpad Prism8.0處理后，顯示 （-）-Gallocatechin gallate對新型冠狀病毒主蛋白酶的IC ?50為（2.104 ± 0.346） μmol/L，而Scullarein的這個值為（10.79 ± 2.116） μmol/L，從結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，（-）-Gallocatechin gallate在160 μmol/L時對新型冠狀病毒主蛋白酶的抑制效果也達(dá)不到100%，最大抑制率為97%，而Scullarein在20 μmol/L時對新型冠狀病毒主蛋白酶的抑制率就達(dá)到了100%.

3.5 分子動力學(xué)模擬結(jié)果

根據(jù)分子動力學(xué)模擬軌跡，我們消除了主蛋白酶的平動和轉(zhuǎn)動，以蛋白質(zhì)骨架為基準(zhǔn)，提取了復(fù)合物的RMSD，蛋白骨架相對于其本身的RMSD趨勢與復(fù)合物RMSD趨勢一致，因此此處僅展示兩個復(fù)合物RMSD結(jié)果. （-）-Gallocatechin gallate與SARS-CoV-2主蛋白酶復(fù)合物在20 ns的分子動力學(xué)模擬中RMSD平均值為0.225 647 2，Scutellarein與主蛋白酶復(fù)合物RMSD平均值為0.223 724，從結(jié)果可以看出，這兩個天然產(chǎn)物與新型冠狀病毒主蛋白酶結(jié)合都較為穩(wěn)定.

此外，我們分析了新型冠狀病毒主蛋白酶與兩種天然產(chǎn)物抑制劑的主要結(jié)合位點(diǎn)，如圖7所示.（-）-Gallocatechin gallate的羥基與主蛋白酶的Asn142殘基形成了氫鍵，其六元雜環(huán)上與羧基相連的H與Gln189形成了碳?xì)滏I，屬于非極性鍵，其上一個苯環(huán)與Glu166形成了Ⅱ-陰離子相互作用，另一個苯環(huán)與His41形成了Ⅱ-Ⅱ堆積，與Arg188形成了酰胺-Ⅱ堆疊相互作用.如圖8所示，Scutellarein中與六元碳環(huán)相連的苯環(huán)與Asn142形成了Ⅱ-孤電子對相互作用，而Glu166可能與苯環(huán)或其旁邊的六元碳環(huán)存在Ⅱ-陰離子相互作用，六元碳環(huán)可能與Leu141存在酰胺-Ⅱ堆疊作用或者碳?xì)滏I相互作用，六元碳環(huán)上的一個羰基可能還與Ser144或者His172形成了氫鍵.

4 討 論

本研究篩選出了針對新型冠狀病毒主蛋白酶的兩種天然產(chǎn)物抑制劑，所篩選到的兩種天然產(chǎn)物與新型冠狀病毒主蛋白酶已知抑制劑黃岑素和黃岑苷相比，提供了氫鍵受體和配體位置的多樣性，而與一些非共價抑制劑X77和ML188相比，其功效范圍更廣.根據(jù)研究結(jié)果可知，新型冠狀病毒主蛋白酶中的Glu166殘基與兩種天然產(chǎn)物都形成了Ⅱ-陰離子相互作用，提示我們在藥物設(shè)計(jì)中需要關(guān)注芳香環(huán)的位置.總之這些結(jié)果為新型冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)提供了新的思路.

在上述結(jié)果中我們提到篩選到的16種天然產(chǎn)物盡管有些對新型冠狀病毒主蛋白酶的抑制效果不是很好，但不能排除它們在其他方面所起的作用.事實(shí)上，我們也在虛擬篩選得到的結(jié)果中針對新型冠狀病毒類木瓜蛋白酶進(jìn)行了虛篩，結(jié)果顯示有些天然產(chǎn)物可能對新型冠狀病毒類木瓜蛋白酶有潛在的抑制作用.

研究表明（-）-Gallocatechin gallate大多來源于綠茶，為多酚物質(zhì)，具有抗炎抗氧化作用，而Scutellarein為菊科植物燈盞花中的黃酮類物質(zhì)，在抗感染抗菌等方面發(fā)揮重要作用.由于新型冠狀病毒會引起人體炎癥因子的釋放，而這兩種天然產(chǎn)物既是新型冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑，又是良好的抗炎殺菌藥物，因此值得后續(xù)研究 ?［20，21］.

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