基于PacBio16SrRNA基因全長測序調查某校園水體微生物群落結構及多樣性研究

葉玨妃 張逸博 萬晶 黨晨原 付杰

關鍵詞：微生物多樣性；群落結構；水體；16S rRNA基因全長測序

前言

微生物是淡水系統中的重要組成部分，其種類眾多且組成復雜，這種多樣性使得環境中微生物群落的結構和代謝功能出現差異，進而對水生生態系統的功能產生不同的影響。同時微生物對其所處水生環境的變化十分敏感，能夠反映出水環境的質量和水生態系統的穩定性。如今微生物研究廣泛采用16S rRNA基因測序技術，特別是近年來，16S rRNA基因全長測序技術的應用，使得我們能夠獲得環境微生物群落的高分辨率結構（精確到種、甚至菌株）。

空氣、土壤以及水體等是校園環境的重要組成部分，其環境狀況會對人們的身心健康產生影響。近年來關于校園土壤環境的研究集中于重金屬污染方面，空氣環境研究則主要關注微生物污染，水環境方面的研究主要關于理化指標，如河流中的氮磷污染與富營養化、地表水中三氮的變化情況、雨水水質分析等，而關于校園水體環境中微生物組成以及理化指標對微生物群落結構影響的研究相對較少。

因此研究以武漢市洪山區某高校水體作為研究對象，該校園分布著多處水體，主要包括源湖、南一樓西湖和東湖、醉晚亭西湖和東湖、東九湖以及仍在修復恢復期的湖溪河等。通過PacBi0 16S rRNA基因全長測序的方法來調查該校園水體微生物的組成結構、豐度及多樣性，以加深對校園淡水生態系統的了解，為校園水體的治理和改善等措施提供了數據基礎與理論參考。

1材料與方法

1.1樣本采集

根據《地表水與污水監測技術規范》（HJ/T 91-2002）進行布點和采樣。水樣采集于2021年9月7日，采樣水體分別為源湖、南一樓湖西湖、南一樓湖東湖、醉晚亭西湖、醉晚亭東湖以及東九湖。現場采用便攜式儀器測量水樣的pH、溶解氧和溫度，剩余水樣保存于試劑瓶中運回實驗室，部分樣本用于檢測化學需氧量、氨氮和總磷，剩余樣本冷藏保存備用。

1.2DNA提取和PCR擴增

使用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取水樣中的微生物群落基因組DNA。對微生物的16SrRNA基因的V1-V9區域進行PCR擴增，使用的引物為27F5-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3以及1492R5-RGYTACCTTGTTACGACTT-3。使用2%的瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences， UnionCity．CA，USA）進行回收產物純化。

1.3文庫構建和測序

使用Pacific Biosciences SMRTbellTM TemplatePrep kit1.0試劑盒對擴增子混合物進行操作以構建文庫，并在PacBio SequelⅡ上進行測序。所有擴增子測序由上海凌恩生物科技有限公司完成。測序數據以登錄號OEP003661（https：//www. biosi-no. org/node/index）保存在國家組學數據百科全書（NODE）中。

1.4文庫構建和測序

使用SMRTLINK9.0分析軟件處理PacBio下機數據，從而獲得環形一致性CCS序列（circular con-sensus sequencing）。進行操作分類單元OUT（Oper-ational Taxonomic Unit）聚類分析與數據統計。使用Mothur1.35.1計算Chao豐富度指數和Shannon多樣性指數，比較校園不同水體的微生物群落Alpha多樣性的差異。分別選取各樣本在門分類水平和屬分類水平上豐度最高的20個物種數據繪制組分圖。通過PCoA分析圖探討各水體微生物群落間的Beta多樣性。采用冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）進一步探究分析環境因子對微生物群落結構的影響。

2結果與分析

2.1校園各水體的基本理化性質

實驗檢測了pH、溫度、溶解氧（DO）、化學需氧量（COD）、氨氮（NH2-N）、總磷（TP）共6項理化指標，并且依據《地表水環境質量標準》（GB3838-2002）對各水體進行地表水水質評價（如表1所示）。《地表水環境質量標準》中說明I類水主要適用于源頭水；Ⅱ類主要適用于集中式生活飲用水地表水源地一級保護區；Ⅲ類主要適用于集中式生活飲用水地表水源地二級保護區；Ⅳ類主要適用于一般工業用水區及人體非直接接觸的娛樂用水區；V類主要適用于農業用水區及一般景觀要求水域。對比各項指標可知，源湖、南一樓西湖和東湖、醉晚亭西湖湖水質均為Ⅳ類水，醉晚亭東湖水質達到了Ⅲ類水的要求，而東九湖水質在V類水以下，不滿足作為景觀水體的要求。（見表1）

2.2校園水體微生物群落多樣性與物種組成分析

計算了校園6處水體的Alpha多樣性指數。南一樓西湖、南一樓東湖、源湖的Chao指數和Shannon指數均較高，Chao指數分別為3818.00、3750. 46、3932.00，Shannon指數為11.36、11.22和11.44。東九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭東湖的Chao指數（分別為1239. 18、2809. 18、1951. 28）和Shannon指數（分別為9.38、9.09、8.96）均低于上述3處水。以上數據表明，南一樓西湖、南一樓東湖和源湖微生物群落的豐富度和多樣性都較高。而剩下的東九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭東湖這3處水體的群落豐富度和多樣性則均較低。其中源湖的Chao指數和Shan-non指數最高，微生物群落的豐富度和多樣性都是最高的。Chao指數數值最低的是東九湖，具有最低的物種豐度，群落多樣性最低的水體是醉晚亭東湖，Shannon指數數值最小。

6個水體樣本中共有40個菌門，其中在門分類水平上，相對豐度排名前10的菌門如圖1（a）所示，變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacte-roidetes）和放線菌門（Actinobacteria）在6個水體樣本中均為優勢菌門。東九湖和源湖中Proteobacteria和Bacteroidetes的豐度總和均超過了70%。但醉晚亭東湖、南一樓西湖和東湖中其余菌門的豐度總和均接近50%，醉晚亭西湖中Proteobacteria和Bacte-roidetes的豐度總和僅為33.51%，其余菌門的占比達到了66.49%。其余高豐度菌門在各樣本中的相對豐度也呈現出差異，藍細菌門（Cyanobacteria）在醉晚亭西湖和東湖中的占比較高，分別為14.94%和15.90%，但在東九湖中僅為0.28%；其在南一樓西湖中的占比為11.94%，但在南一樓東湖中占比僅為5.78%。厚壁菌門（Firmicutes）在醉晚亭西湖中的占比為24.65%，但在源湖和醉晚亭東湖中占比較低，分別為1.2%和1.59%。醉晚亭西湖和東湖樣本相對豐度排名前5的菌門中，共有的優勢菌門包括Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria和浮霉菌門（Planctomycetes）；南一樓西湖和東湖樣本相對豐度排名前5的菌門中，共有的高豐度優勢菌門包括Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Planctomycetes。

6個水體樣本中共含有727個菌屬，如圖1（b）所示為屬分類水平上相對豐度排名前20的菌屬。假單胞菌屬（Pseudomonas）和分支桿菌屬（Mycobacterium）為醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖樣本中含量較高的菌屬，Pseudomonas在4個樣本中的相對豐度分別為4.81%、27.83%、8.91%和6.54%，Mycobacte-rium的占比則分別為5.11%、8.33%、7.89%和9.39%。醉晚亭西湖中含量最高的菌屬為微小桿菌屬（Exiguobacterium），其相對豐度達到了23.11%。黃桿菌屬（Flavobacterium）在東九湖和源湖樣本中的含量較高，分別為7.64%和12.54%。萊茵海默氏菌屬（Pararheinheimera）在源湖中的含量較高，達到了8. 42%。硫酸曲菌屬（Sulfuricurvum）在東九湖樣本中的相對豐度較高，為9.87%。水體樣本中相對豐度排名前20的菌屬還包括利姆諾螺旋菌屬（Limno-spira）、中間根瘤菌屬（Mesorhizobium）、小梨形菌屬（Pirellula）、諾德拉菌屬（Nordella）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、茉莉亞菌屬（Moorea）、幾丁質單胞菌屬（ Chitinimonas）、阿佐內克蘇思菌屬（Azonexus）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、新鞘氨醇菌（Novosphingobium）等。

2.3校園水體樣本間Beta多樣性分析

如圖2所示水體樣本的PCoA分析圖，結果表明醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖微生物的群落組成較為相似，上述4個水體樣本與東九湖、源湖樣本微生物組成的差異性較大。這說明東九湖和源湖樣本與其他4個水體樣本的物種組成具有較大差異。并且在所有水體樣本中，微生物群落結構最相似的水體樣本是醉晚亭西湖和東湖。

采用冗余分析（RDA）探究環境因子對優勢菌門相對豐度的作用，結果如圖3所示。源湖的菌群結構受到環境因子NH3 -N、TP、pH的影響，南一樓西湖與醉晚亭東湖都主要受到pH、DO的影響，南一樓東湖受到環境因子COD、DO的影響，醉晚亭西湖受到COD、DO的影響，東九湖則主要受到NH3-N、TP、COD的影響。水體中的微生物群落結構受到多種環境因子不同程度的影響，其中NH3-N、TP、DO對水體產生了較大影響。

3討論

水質理化指標評價結果顯示源湖、南一樓西湖和東湖、醉晚亭西湖和東湖的水質均在Ⅳ類以上，只有東九湖水質在V類以下，各個水體的DO、COD、氨氮和總磷均具有一定差別。Alpha多樣性指數分析結果顯示，南一樓西湖、南一樓東湖和源湖微生物群落的豐富度和多樣性均較高，東九湖、醉晚亭西湖和醉晚亭東湖水體的群落豐富度和多樣性則均較低。

6個水體的微生物群落組成相似，主要由Pro-teobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Cyanobacteria等組成，其中絕大多數菌門均屬于Newton等人發現的21個典型淡水細菌門類。Proteobacteria、Bacte-roidetes和Actinobacteria的相對豐度均較高，現有研究發現這3個菌門均為湖泊生態系統中的優勢菌門。Bacteroidetes和Proteobacteria則是富營養化淡水系統中高豐度的微生物群落，徐超等人檢測到太湖藍藻水華暴發期間的優勢細菌門類為Cyanobacteria、Actinobacteria和Proteobacteria，寇文伯等人發現鄱陽湖表層水體的菌群主要隸屬于Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria。醉晚亭西湖和東湖以及南一樓西湖的Cyanobacteria的相對豐度均較高，但東九湖中的Cyanobacteria豐度僅為0.28%。這可能是水體中氨氮和總磷含量的差異所導致，醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖中的氨氮含量均低于0.7mg/L，總磷含量低于0. 04mg/L，Cyanobacteria已被證明能夠在繁殖過程中消耗氮和磷，這表明醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖中的Cyanobacteria能夠有效利用水體中的氮磷實現豐度的增加。

屬分類水平上的分析結果顯示不同水體樣本中各菌屬的相對豐度比例差異較大，部分菌屬在某樣本中優勢明顯，但在其余樣本中相對豐度占比極低。Pseudomonas和Mycobacterium為醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖樣本中含量較高的菌屬，但Mycobacterium在東九湖中的占比僅為0.51%；東九湖和源湖樣本中含量較高的菌屬是Flavobacterium，但醉晚亭東湖和南一樓西湖中的Flavobacterium相對豐度都在1.00%以下。

PCoA圖的分析結果表明醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖微生物的群落組成較為相似，上述4個水體樣本與東九湖、源湖樣本微生物組成的差異性較大。RDA分析表明水體的微生物群落結構和多樣性受到NH3 -N、TP、pH、COD、DO等環境因子的影響，其中NH3-N、TP、DO對校園水體的微生物群落產生了較大影響。

4結論

該校園中的源湖、南一樓西湖和東湖、醉晚亭西湖和東湖的水質均在Ⅳ類以上，東九湖水質在V類以下，80%的水體達到了《地表水環境質量標準》中一般景觀水體的要求。不同水體微生物群落的結構和多樣性具有顯著差異，源湖、南一樓西湖和東湖的群落豐富度和多樣性均較高，東九湖、醉晚亭西湖和東湖水體則較低。具體表現為水體的菌門和菌屬的組成與豐度有所不同，呈現出復雜的變化情況。Be-to多樣性分析結果顯示空間距離小的水體的群落組成具有更大的相似性，醉晚亭西湖和東湖、南一樓西湖和東湖的組成相似，東九湖與源湖與上述水體群落結構差異較大。水體群落多樣性受外界環境因素影響，總體上主要受到環境因子NH3-N、TP、DO的影響。