水環境中抗生素的分析檢測技術研究進展

王錦 劉珂 梁柳玲 田艷 黃寧

關鍵詞：水環境；新污染物；抗生素；分析檢測技術；綜述

前言

2022年國務院印發了《新污染物治理行動方案》，方案中將規范抗生素藥物的使用作為工作目標之一，并將抗生素納入了《重點管控新污染物清單》，列為四大典型新污染物之一。抗生素在人類預防細菌和治療感染性疾病方面發揮了重大作用，但是，由于抗生素的大量頻繁使用，近年來，地表水、地下水、飲用水、污水等多種水環境介質中都能檢測出不同濃度的抗生素。有文獻[1]報道在南明河地表水中共檢出34種抗生素，平均含量為257ng/L．其中大環內酯類抗生素檢出濃度最高。Fang-ZhouGao等分析檢測了養豬村莊井水中的18種抗生素，發現主要污染物是磺胺類抗生素，某一養豬場所用的井水總抗生素濃度超過1200ng/L。崔敬鑫等對菜田水溝、池塘和水井等水樣中的15種抗生素進行檢測，發現5類抗生素被不同程度檢出，濃度范圍為0.1～106.2ng/L。這些研究結果表明中國水環境抗生素污染問題已凸顯，污染形勢嚴峻，其環境風險與生態毒理效應不可忽視。

目前，國內外抗生素的監測技術主要有酶聯免疫法、毛細管電泳法、液相色譜一熒光法、液相色譜一紫外法和液相色譜一串聯質譜法等。其中酶聯免疫法和毛細管電泳法不適合痕量級別抗生素的檢測，紫外和熒光檢測器只能選擇性檢測某些物質。文章綜述了水環境中抗生素的分析檢測技術，重點綜述了近年來水體中抗生素的前處理方法和儀器分析檢測技術

1水環境中抗生素的危害、來源以及污染途徑

抗生素的濫用使其源源不斷地排人環境中，而大多數抗生素的極性較強，具有親水性和揮發性弱等特性，可以較為方便的借助各種環境介質在土壤、水體和沉積物之中擴散，從而造成了畜類食品、禽類食品、水產品、水體和土壤的污染。此外，抗生素在生物體內可促進細菌耐藥性的產生、傳播及耐藥菌群的形成，進而對水環境的生態安全及人體健康構成威脅。

水環境中的抗生素主要來源于生活污水、畜牧業和水產養殖業的廢水、制藥企業的工業廢水和醫院的醫療廢水等?？股厣a過程中的工業廢水經過污水處理能去除一部分抗生素，未能去除的抗生素則排入水環境中。進人人體內的抗生素，部分被吸收代謝，未被吸收的抗生素排出體外后通過生活污水或醫院醫療廢水進入水環境中。在畜牧業和水產養殖業養殖過程中，含有抗生素的動物的尿液和糞便或進入污水中，或常常被用作有機肥料，抗生素通過滲透作用和雨水溢流進入地表水和地下水，或殘留在土壤中。特別是水產養殖，抗生素被直接噴灑在養殖水體中，極可能殘留在附近水環境中或吸附在底泥中。

2水環境樣品中抗生素的預處理和萃取過程

水環境中抗生素的含量相對較低，水溶性比較大，且基質十分復雜，干擾物多，為分離與富集技術提出更高的要求，對于水環境樣品中抗生素的預處理方法主要有分散液液微萃取法、凍干法、固相萃取法等，其中固相萃取法運用最普遍。

2.1分散液液微萃取法

分散液液微萃取相當于微型化的液液萃取，因其萃取操作簡便、時間短、富集倍數高、溶劑用量少，適用水樣中殘留污染物的提取。陳文勝等以乙腈為分散劑，正戊醇一甲基叔丁醚為萃取劑萃取水樣中的抗生素，萃取時間短，僅用了4min，回收率可達到66.4%～94.0%。但是，方法使用了毒性較大的二氯甲烷和醚類等試劑，對生態環境和人體健康形成危害。由此可見分散液液微萃取也有其局限性，如分散劑和萃取劑種類單一且毒性較大等。

2.2凍干法

凍干法是在低溫和真空條件下，通過升華的方式除去樣品中的水分，抗生素的結構不易發生改變，極易重新溶解，保證了樣品中分析物的活性。Feng-Yang Hu等采用凍干法對環境水樣中6種常用抗生素進行富集，在1L水樣加入1g檸檬酸，在一80℃條件下放置至少3小時，將50mL水樣凝結，再將樣品轉移到冷凍干燥器，在-86℃和0.1mbar的真空狀態下凍干，用1mL10%甲醇一水溶液（0.1%甲酸）超聲復溶，該方法對低、中、高三個濃度水平的抗生素回收率均大于70%，檢出限可達到ng/L。但是，冷凍干燥法所需時間太長，與當前檢測要求時效性高的形勢不相符。

2.3固相萃取法

固相萃取法可通過吸附劑和洗脫液選擇性地保留與洗脫目標物，從而實現從復雜樣品中富集、分離和純化目標物的目的。如表1所示近幾年富集水樣中不同種類抗生素和多種類抗生素殘留的固相萃取方法。因為復雜樣品含有較多的多價態金屬離子，這些離子與大環內酯類、喹諾酮類和四環素類抗生素形成螯合物從而降低回收率，大多數研究在水樣富集之前加入Na2EDTA以螯合金屬并釋放出抗生素。水樣pH會嚴重影響化合物的結構、穩定性以及化合物與固相萃取填料之間的作用力，需用酸或堿調節pH使抗生素以分子的形式存在，更好地保留在親水親酯柱（HLB）上以提高富集效率。

青霉素類抗生素的結構中大多包含β-內酰胺環，在環境中很容易水解。由于β一內酰胺環對pH值、溫度和β-內酰胺酶很敏感，因此要求對抗生素殘留的檢測方法必須靈敏、快速、高效。李欣等采集水樣后在24小時內采用HLB柱富集凈化樣品中的青霉素，利用液相色譜串聯質譜法進行分析檢測，回收率為76.4%。

大環內酯類抗生素包含了一個堿性二甲胺基，屬于弱堿性化合物。水樣pH對某些大環內酯類抗生素影響比較大，有研究發現，當水樣pH在3～7之間時，大環內酯類抗生素可被保留在反相萃取填料中，但是，紅霉素在酸性條件下會加速降解，轉化為脫水紅霉素；在酸性和堿性條件下，泰樂霉素不穩定，在中性環境中相對穩定。因此，將水樣調到6～7，可提高紅霉素和泰樂霉素的回收率，侯錦瑩等將地表水水樣酸度調為中性，通過HLB小柱富集5種大環內酯類抗生素，回收率在85.4%～96.6%之間。

喹諾酮類抗生素是目前國內外研究比較多的一類抗生素，其分子結構包含羧基，第二代喹諾酮類抗生素在雜環上還有一個氨基。喹諾酮類抗生素根據其酸堿性質被分為兩類：酸性和有雜環的喹諾酮，含有雜環的喹諾酮類抗生素屬于兩性化合物。成曉葉等比較了HLB柱、C18柱和硅膠柱富集水中18種喹諾酮類抗生素，結果發現，在水樣pH=10時，采用HLB柱喹諾酮具有較好的回收率，其他許多研究也考察了萃取柱對喹諾酮類的富集效果，結果是使用HLB柱時喹諾酮類抗生素的平均回收率最高。

磺胺類抗生素分子結構包含一個堿性氨基基團和一個酸性磺胺基基團，屬于兩性化合物，水樣pH對磺胺類抗生素的富集凈化具有重要影響，多數研究將水樣品pH調至酸性后用HLB富集磺胺類抗生素。四環素類抗生素含有并四苯基本結構，在酸、堿中不穩定．此外，含有活性基團，如羰基、烯醇羥基和羥基，在中性條件下易與金屬離子形成螯合物。四環素類抗生素與硅醇基有很強的相互作用力難以洗脫，但HLB柱不含有硅醇基，因此較適合四環素類抗生素。

近年來水環境中抗生素的研究日漸趨向于多種類抗生素殘留同時分析檢測，可實現水環境中抗生素污染水平的快速篩查。HLB小柱具有親水親酯性，在酸性、堿性和中性條件下均適用，成為多種類抗生素殘留分析首選萃取柱，其次，抗生素酸堿性差異大，水樣的pH優化尤為重要。崔敬鑫等將水樣pH調至4，采用固相萃取技術富集環境水樣中5大類15種抗生素，分析種類多，分析時間快，效率高。封夢娟等將1L表層水體pH調至3，采用HLB柱富集磺胺類、喹諾酮類、大環內酯類、四環素類和青霉素類等40種抗生素，平均加標回收率為41.3%～112.6%，共檢出13種抗生素。

綜上所述，傳統的液液萃取法雖然無需復雜前處理設備，成本低，但是容易出現乳化現象，增加萃取難度，此外手工操作繁瑣，難以實現自動化，且需使用大量的毒性大的有機溶劑，損害人體健康，污染環境，不利于生態環境保護和生態文明建設。與液液萃取相比，分散液液微萃取具有溶劑使用量低、富集倍數高、易實現自動化等優勢，但因萃取溶劑單一，而抗生素種類多樣，性質各異，使其不適用復雜環境中多種類抗生素的萃取。凍干法因處理日寸間過長，已逐漸被淘汰。在樣品前處理技術中，固相萃取法集分離、富集、凈化于一體，具有較高的選擇性和重現性，被廣泛應用于水樣中抗生素富集凈化?，F在市場上已有全自動固相萃取儀和免活化的固相萃取柱，可有效減少溶劑耗費和避免萃取柱堵塞，從水樣萃取到濃縮過程自動化程度更高，省時又省力，如此，固相萃取法的應用更加廣泛。此外，在線固相萃取技術成為近些年研究的熱點，因其具有固相萃取柱重復使用、可實現全自動的前處理和減少系統誤差等優點，可進一步加速多殘留污染物的快速篩查，特別適用于突發應急事故檢測。

3抗生素的分析檢測技術

抗生素種類繁多，且環境介質中抗生素的殘留量為痕量水平，對抗生素殘留的檢測技術水平要求較高，目前國內也推出了幾個地方標準和團體標準，這幾個標準均采用液相色譜串聯質譜法測定抗生素。現有的抗生素殘留分析方法主要有酶聯免疫分析法、高效液相色譜法和高效液相色譜質譜聯用法。其中酶聯免疫法不適合痕量級別抗生素的檢測。液相色譜對大分子量、溶解性有機化合物具備高分離能力，常配備紫外檢測器、熒光檢測器或將質譜做檢測器，但是紫外和熒光檢測器只能選擇性檢測某些物質。如表2所示近幾年采用液相色譜一串聯質譜法分析不同水質中抗生素的檢出限、回收率及樣品濃度。

3.1液相色譜一紫外檢測法（LC-UV）

LC-UV具有分析速度快、線性范圍寬的特點，常用于分析極性強、揮發性低、穩定性差的化合物。但是液相色譜一紫外檢測法只依據保留時間定性，抗干擾能力弱，有可能會出現假陽性，且靈敏度低。對于某些沒有特征紫外吸收的抗生素難以實現高靈敏度的分析，特別是大部分大環內酯類抗生素，如羅紅霉素、阿奇霉素、竹桃霉素等，因缺少發色功能團，沒有紫外吸收。不同化合物結構中含有不同的基團，其紫外吸收最大波長不盡相同，常用LC-UV法選擇在260～290nm之間作為最大吸收波長測定磺胺類、四環素類和喹諾酮類抗生素，如喹諾酮類抗生素采用紫外波長為248nm或274nm，磺胺類抗生素的檢測波長為270nm，檢出限可達ng/L。

3.2液相色譜一熒光法（LC-FLD）

大多數喹諾酮類抗生素自身有較強熒光吸收，而熒光檢測器僅對有熒光吸收的化合物有響應，且選擇性好，靈敏度高。喹諾酮類抗生素的激發波長和發射波長分別為276～297nm和444～506nm，檢出限可達幾個ng/L?；前奉惡痛蟓h內酯類等抗生素本身沒有熒光吸收，對于這些不發熒光的化合物其測定過程中需要進行衍生，而大環內酯類抗生素在熒光衍生化過程易導致分解，如紅霉素。步驟繁瑣且重現性較差等缺陷限制了熒光檢測器的應用。

3.3液相色譜一串聯質譜法（HPLC-MS/MS）

HPLC-MS/MS是以高效液相色譜為分離手段，質譜為檢測器的一種重要的用于分離和鑒定的檢測技術，不僅具有柱效高、分析速度快和化學基質干擾小等特點，而且檢測靈敏度高、特異性強，以滿足樣品中痕量物質的分析，還可以給出化合物的分子量以及豐富碎片信息，以便進一步確證化合物結構，極大的提高了定性定量分析能力，避免生物法在特異性和準確性方面的欠缺，也可彌補液相色譜法定性困難抗干擾能力弱的不足，成為復雜樣品中物質分離分析研究的不可缺少有效手段，是同時檢測多殘留抗生素的理想工具。

HPLC-MS/MS分析多殘留抗生素，基質干擾小，可用于檢測不同基質的水樣，檢出限可達ng/L，甚至pg/L。王婭南等采用SPE-HPLC-MS/MS分析地表水中15種磺胺類、9種氟喹諾酮類、7種大環內酯類、3種四環素類、2種氯霉素類和4種其他類共40種抗生素，方法檢出限為0.002～0.270ng/L，加標回收率為61.0%～149%。也有研究采用SPE-HPLC-MS/MS．測定地下水和地表水中磺胺類、四環素類、氟喹諾酮類、大環內酯類和氯霉素類15種抗生素，保留時間在5.5min內，分析時間短，檢出限為2.1～22.0ng/L，回收率為50.1%～109%。王錦[10]等建立了分析檢測水庫、地表水、污水處理廠出口、畜禽養殖場等不同類型水樣中喹諾酮類、大環內酯類和青霉素類抗生的SPE-HPLC-MS/MS法，方法檢出限為2.3～10.7ng/L，回收率為61.2%～129%。

綜上所述，液相色譜法是分析水樣中抗生素較為普遍的方法，對抗生素的檢測均有較好的選擇性和精密度。但液相色譜一紫外檢測法和液相色譜一熒光法具有局限性，只能檢測有特征紫外吸收或發熒光的抗生素，且靈敏度不夠，抗干擾能力差，容易出現假陽性，在當前復雜的環境污染情況下，不適用于同時分析基質復雜水樣中多種類抗生素。而液相色譜一串聯質譜法正好克服了液相色譜一紫外檢測法和液相色譜一熒光法的缺點，利用液相色譜高效分離和串聯質譜準確定量的能力可實現抗生素高質量的檢測，成為當前同時檢測復雜樣品中多殘留抗生素的理想分析方法。

4結束語

文章綜述了國內外近年研究水環境中抗生素的檢測技術，結合各類抗生素的化學性質對前處理技術和液相色譜檢測技術的優缺點進行了重點闡述，并對方法中可能影響萃取效率和分析檢測的各種因素進行了分析總結。國內外相關研究已經很多，國內地方標準中抗生素組分少，類別少，不足以檢測多殘留抗生素。由于抗生素種類多樣化，性質各異，建立環境介質中最佳的多殘留抗生素分析檢測標準方法以監控和了解環境中抗生素的濃度水平將會是一項重大挑戰，建立健全統一的國家標準體系以摸清抗生素環境賦存底數，進一步控制和管控抗生素對環境的污染以及研究抗生素治理技術已迫在眉睫。在線篩查和監測環境水體中的抗生素轉移和代謝物將是今后發展的方向。