澳洲堅果葉部病害病原菌鑒定及其生防菌篩選

摘 要：【目的】澳洲堅果是云南省德宏傣族景頗族自治州（簡稱為“德宏州”）的百姓為脫貧致富而種植的重要木本油料樹種，集約化種植使其植株葉枯病嚴重發生。為了明確澳洲堅果葉部病害病原菌的種類并篩選有效生防菌，為澳洲堅果葉枯病的綠色防控和澳洲堅果的產業化發展提供理論支持。【方法】對云南省德宏州潞西市遮放鎮拱嶺村、三臺山鄉允欠村和風平鎮帕底村澳洲堅果主要種植基地（即3 個樣地）內的葉枯病進行專題調查，將采集于此3 個樣地的病害樣本進行分離培養，采用柯赫氏法則驗證其致病性，結合生物學特征和多基因片段構建系統發育樹，明確病原菌的分類與地位，并采用兩點對峙法進行生防菌的篩選。【結果】遮放鎮拱嶺村、三臺山鄉允欠村和風平鎮帕底村3 個樣地的發病率分別為60%、64% 與69%，平均發病率為64.3%，說明3 個樣地的發病情況均較嚴重；其平均病情指數為32，說明3 個樣地的病情指數均較高。在實驗室中共分離鑒定出病原真菌8 屬10 種、生防菌1 屬1 種。其中，DH06 和DH10 的分離頻率分別為30.83% 與24.17%，這2 種菌株均被確定為優勢病原菌；對其致病性的分析結果表明，這2 種菌株均能使澳洲堅果葉片產生葉斑病癥狀，且其發病癥狀與野外的發病癥狀相同。所構建的系統進化樹顯示，DH06 菌株被鑒定為污斑新擬盤多毛孢Neopestalotiopsis foedans，DH10 菌株被鑒定為小孢擬盤多毛孢菌Pestalotiopsis microspora。平板對峙實驗結果表明，由健康葉片上分離出的DH14 對幾種病原菌都有較好的拮抗作用，其平均抑菌率為60.56%，對其形態及分子的鑒定結果均表明，DH14 菌株被鑒定為哈茨木霉Trichoderma harzianum。【結論】云南省德宏州澳洲堅果葉枯病與葉斑病的病原菌分別為污斑新擬盤多毛孢菌和小孢擬盤多毛孢菌，篩選出的生防菌為哈茨木霉，其對病原菌有顯著的抑菌效果。

關鍵詞：澳洲堅果；葉部病害；病原鑒定；柯赫氏法則；生防菌篩選

中圖分類號：S664.9；S763.1 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）01—0282—10

澳洲堅果Macadamia integrifolia Maiden amp; Betche是山龍眼科Proteaceae 澳洲堅果屬Macadamia 的常綠喬木樹種，其果實具有較高的營養價值和藥用價值。近年來，國內外有關澳洲堅果的研究多聚焦于堅果油脂方面[1-2]。我國大陸地區自1979 年開始從澳大利亞引進此樹種，因此我國對澳洲堅果病害的研究起步較晚，關于澳洲堅果病蟲害的研究報道也較少。但是，隨著澳洲堅果的大量栽培，澳洲堅果葉枯病的發生態勢也日漸嚴峻。

目前，云南省已經成為全球最大的澳洲堅果種植生產區[3-5]，而德宏傣族景頗族自治州（簡稱為“德宏州”）又是云南省的澳洲堅果主產區。所以，有關該地區澳洲堅果病害調查、病原菌鑒定及生防菌篩選的研究對該地澳洲堅果的生產具有一定的指導意義[6]。

為了明確澳洲堅果葉部病害的病原菌種類并篩選出有效生防菌，針對德宏州所種澳洲堅果的病害，采用組織分離法，分離出該地區澳洲堅果葉部病害的病原菌，通過對其外部癥狀的觀察、病原菌的形態學鑒定、以科赫法則回接實驗及對病原菌的分子鑒定，篩選出合適的生防菌，以期為澳洲堅果葉部病害的有效防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

2019 年3 月上旬—2020 年4 月上旬，選擇云南省德宏州潞西市澳洲堅果主要種植區內澳洲堅

果葉枯病發生嚴重的遮放鎮拱嶺村、三臺山鄉允欠村和風平鎮帕底村為采樣地，從這3 個樣地中分別采集具有明顯的葉部病害發病癥狀的病葉和完全健康的葉片兩類葉片樣品，將所采樣品置于低溫保濕條件下帶回西南林業大學微生物實驗室以備用。

1.2 澳洲堅果葉部病害的調查

2019 年3 月上旬—2020 年4 月上旬，對德宏州潞西市的遮放鎮拱嶺村、三臺山鄉允欠村和風平鎮帕底村這3 個樣地的發病情況進行普查，并對其中發病嚴重的區域進行專題調查，每個樣地以棋盤式方法各隨機抽取50 株澳洲堅果植株，分別從每株樹的東、南、西、北4 個方向調查其葉枯病的病葉數，計算其發病率，并參考楊光道[7]采用的分級標準（表1），分別計算3 個樣地的發病率及病情指數，并采集具有葉枯病典型癥狀的葉片標本，將其保存于西南林業大學生物多樣性病理學實驗室內。

1.3 病原菌的分離與純化

采用組織分離法分離病原菌。用無菌刀片切取病健交界處的小組織塊，在超凈工作臺中，以75% 的酒精給葉片組織消毒3 ～ 5 s，然后以0.1%的升汞消毒1 min，再用無菌水沖洗3 次，最后用無菌濾紙片將水分吸干，將其接種于PDA 培養基平板上，每個平板接種4 塊葉片組織。將平板放入25 ℃的恒溫培養箱中培養，待長出菌絲后及時將菌絲接種到新的PDA 平板上進行純化培養。按此步驟重復操作直至獲得純菌落，再將得到的純菌落轉接至PDA 斜面試管中，待菌落長滿后，放入4 ℃的冰箱中保存[8] 以備用。

1.4 病原菌致病性的測定

分別采用離體燙傷接種法和針刺法測定病原菌的致病性。選用健康的澳洲堅果葉片進行回接，先用酒精棉擦凈葉片表面，接著用無菌接種針作針刺處理或燙傷葉片表面，用打孔器打取直徑為5 mm的菌絲塊，將其貼于葉片接種處，然后將浸泡過無菌水的無菌脫脂棉綁在菌餅上，再將處理過的葉片平鋪于瓷盤中，最后用保鮮膜將瓷盤密封好并進行保濕處理，在保鮮膜上扎10 個小孔以保證透氣性。每個菌株各設3 次重復試驗，以接種無菌水為陰性對照，于25 ℃條件下進行保濕培養并觀察記錄，待病狀發生后取出再次分離培養[9-10]。

1.5 病原菌的形態學鑒定

利用徒手切片法制作臨時玻片，利用光學顯微鏡對菌種進行初步的形態學鑒定。將純化好的菌株接種在PDA 培養基上，放入25 ℃的恒溫恒濕培養箱中，每日對其生長速率、顏色、質地、產孢及是否會分泌色素等狀態進行觀察并拍照，根據菌種的形態特征對其進行鑒定。

1.6 病原菌的分子鑒定

使用真菌試劑盒對分離純化獲得的純菌株進行DNA 的提取，以提取出的DNA 為模板，擴增ITS 片段及β-tubulin 基因，采用50 μL 的反應體系進行PCR 擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

當凝膠電泳檢測所獲PCR 產物的大小與目標產物的大小一致時，再將樣品送至北京擎科生物公司進行序列檢測。將檢測到的序列拼接后，利用NCBI 數據庫進行Blast 序列比對，挑選出與供試菌株同源性高的同屬近緣種，并從NCBI 數據庫中下載該菌株的ITS 及β-tubulin 基因，使用MEGA6軟件中的鄰接法構建其系統發育樹[11-12]。

1.7 病原菌生防菌的篩選

用平板對峙法進行生防菌的篩選。將病原菌和對峙菌對稱接種于平板兩側，其間距為4 cm，置于25 ℃的恒溫條件下培養，定期記錄，最終選取具有明顯對峙帶或生長速率快的菌種作為生防菌。對所選生防菌進行形態及分子鑒定，確定該菌種的歸屬。用篩選出來的拮抗菌對所有的病原菌開展對峙實驗，觀察對峙培養1、3、7、10 d 后拮抗菌與病原菌的生長狀況，觀察拮抗菌的抑菌穩定性，并按魏玉倩等[13] 所用公式計算其抑菌率。

抑菌率=（對照菌落直徑- 處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

2 結果與分析

2.1 澳洲堅果葉枯病的調查結果

對3 個樣地的病害調查結果表明，澳洲堅果葉部病害主要表現為澳洲堅果枯斑病和澳洲堅果灰斑病。調查中發現，此病害主要危害葉片，有時也危害果實。此病害多發生在葉緣或葉尖處，初期葉上出現褐色小斑點，隨著發病時間的延長，逐漸擴大為不規則的褐色大病斑，逐漸發展為灰色大斑，其上密布黑色小點，即病原菌的分生孢子盤（圖1A），后期病斑中央呈現灰褐色且密生小黑點[14]（圖1B）。

對3 個樣地的澳洲堅果葉枯病害進行了專項調查，結果見表2。由表2 可知，遮放鎮拱嶺村、三臺山鄉允欠村、風平鎮帕底村的植株發病率分別為60%、64%、69%，其病情指數分別為29、32、35；3 個樣地的平均發病率為64.3%，平均病情指數為32。由此可知，德宏州澳洲堅果種植園內，葉部病害較為嚴重，發病程度較高。

2.2 病原菌的分離結果

采用組織分離法分離病原菌，獲得純化菌株。

共分離了30 個平板的病原菌，共獲得10 類菌株，其編號分別為DH01、DH02、DH03、DH04、DH05、DH10、DH11、DH13、DH14、DH17，其出現頻率見表3。由表3 可知， 編號分別為DH04 與DH10 的菌株出現的頻率均較高，分別為30.83% 和24.17%，故將這2 種菌株作為目標菌株用于后續致病性的測定中。

2.3 病原菌致病性的測定結果

離體組織回接結果表明，DH06、DH10 均有較強的致病性，且室內回接結果與野外發病癥狀相似。由DH06、DH10 菌株引發的葉斑病癥狀如圖2 所示。從圖2 中可以看出，葉片下部使用針刺法接種，葉片上部使用燙傷法接種，其回接癥狀與自然發病的癥狀一致。用組織分離法對發病葉片進行再分離，再分離所得菌株的菌落形態與分生孢子形態跟接種的原始分離物均一致，表明DH01、DH10 菌株均為致病菌株。

2.4 病原菌的形態學特性

DH06 菌落在培養基上呈不規則圓形，在培養基的正面長出白色絨毛狀菌絲（圖3A），在培養基的背面呈淡黃色（圖3B），培養后期在菌株中央長出黑色小點，其為分生孢子。該菌株的產孢結構為分生孢子盤，其分生孢子有5 個細胞，有4 個隔膜，中間的３個細胞均呈暗色，兩端細胞均無色，分生孢子兩端均具有毛狀附屬絲，一端有1 根，另一端則有2 ～ 3 根，分生孢子大小為（13.5 ～ 22.0）μm×（6.5 ～ 9.5）μm（圖3C—D）。

DH10 菌落在培養基上呈圓形，具有花瓣樣層次，培養初期菌落正面呈不規則圓形的白色絨毛狀，培養后期逐漸具有輪紋（圖4A），菌落背面為黃色，同樣具有輪紋（圖4B）。該菌產孢結構為分生孢子盤，呈褐色，分生孢子盤呈盤狀（圖4C），分生孢子具5 個細胞，梭形或紡錘形，有4 個隔膜，膈膜處有溢縮，中間3 個細胞為暗色，兩端細胞均無色，分生孢子兩端均具有毛狀附屬絲，一端有1 根，另一端則有3 根，且其分開明顯，分生孢子大小為（21.5 ～ 27.5）μm ×（6.5 ～ 9.0）μm（圖4D）。

DH14 在培養基上培養的形態如圖5 所示。菌落生長初期為白色絨毛狀，后期變為黃綠色（圖5A），菌落的背面為黃色，呈星形放射狀（圖5B）。該菌產孢結構為分生孢子梗，分生孢子梗從菌絲側枝上長出，呈對生或互生狀，常具有2 ～3 個分枝，著生分生孢子的小梗為瓶形或錐形。分生孢子為球形，藍綠色（圖5C—D）。

2.5 病原菌的分子鑒定結果

結合ITS 和TUB 序列進行真菌鑒定，通過PCR 擴增DH01、DH10 和DH14 基因，并確定擴增產物新的序列。序列分析結果表明，菌株DH06與GenBank 數據庫中收錄的編號為CGMCC 3.9123的污斑新擬盤多毛孢N. foedans 處于同一分支中，其支持率為97%；菌株DH10 與GenBank 數據庫中收錄的小孢擬盤多毛孢菌株P. microspora 的同源性為100%（圖6）。

綜上所述，結合其形態學特征及分子鑒定結果，將DH06 和DH10 分別初步鑒定為污斑新擬盤多毛孢與小孢擬盤多毛孢。

菌株DH14 與GenBank 數據庫中收錄的哈茨木霉菌Trichoderma harzianum（MG707197、KT336515、MF671942、MK439505、KC569348、JX473718、KT852833、KT192387、MH153617、KC569359、JX473720、JX473716、KC569353）的同源性達到99% 以上。系統發育樹顯示，菌株DH14與親緣關系最近的13 株哈茨木霉菌T. harzianum均處于同一分支中，其支持率達到95%，而與木霉屬內其他真菌的遺傳關系較遠（圖7）。因此可以鑒定，菌株DH14 為哈茨木霉菌T. harzianum。

2.6 病原真菌的對峙實驗結果

選用哈茨木霉為拮抗菌，對分離出的8 種菌株進行對峙實驗，逐日拍照并記錄其數據，并計算抑菌率。對峙實驗結果（圖8）表明，拮抗菌哈茨木霉的生長速率均顯著高于病原菌，其有較強的競爭作用。

哈茨木霉對8 株病原真菌的抑菌率如圖9 所示。由圖9 可知，哈茨木霉對8 種病原菌的抑菌率為50% ～ 70%，平均抑菌率為60.56%。其中，哈茨木霉對污斑新擬盤多毛孢Neopestalotiopsisfoedans 的抑菌效果最好，其抑菌率為66.59%；其次是光輪層炭疽菌Daldinia eschscholtzii， 其抑菌率為65.17%；抑菌效果最差的是Diaporthepseudophoenicicola，其抑菌率為54.59%。由此可見，哈茨木霉能被很好地應用于澳洲堅果葉枯病病原菌生長的防治之中，可以用作防治病原菌生長和繁殖的生防菌，但這只是在實驗室內得出的實驗結果，最后是否能夠真正起到防治效果，還需野外試驗驗證[15]。

3 結論與討論

3.1 結 論

在對云南省德宏州澳洲堅果主要種植區內葉枯病害的專題調查中發現，植株葉片受害情況頗為嚴重，發病率與病情指數均較高，嚴重影響了當地澳洲堅果的產量和品質。從3 個樣地采集的病害標本中共鑒定出病原真菌8 屬10 種、生防菌1 屬1 種。對從中分離出的兩株優勢病原菌進行致病性測定，結果發現，其在室內的發病癥狀與其野外發病癥狀一致。經形態及分子生物學鑒定后確定，這2 株優勢病原菌分別為小孢擬盤多毛孢P. microspora 和污斑新擬盤多毛孢N. foedans，其為引起德宏州澳洲堅果葉部病害的致病菌。利用兩點對峙法篩選出來的一株拮抗菌，經鑒定，為哈茨木霉菌T. harzianum。觀察并計算哈茨木霉對病原菌的抑制率，結果表明，哈茨木霉對污斑新擬盤多毛孢N. foedans、小孢擬盤多毛孢菌P.microspora 和新殼梭孢菌N. parvum 等病原菌的抑制率都在60% 以上，其平均抑菌率為60.56%，也在60% 以上。由此可見，哈茨木霉可以作為有效的生防菌，可用于葉枯病的防治。

3.2 討 論

近年來，云南的澳洲堅果產業規模逐步擴大，云南省的澳洲堅果種植面積在全國的80% 以上，其中德宏州的堅果產量僅次于臨滄市及普洱市，是云南省重要的堅果種植區。集約化的種植使得澳洲堅果葉枯病害日益嚴重。有關研究結果表明，澳洲堅果常見病害主要有葉枯病、衰退病、炭疽病、花疫病、莖干潰瘍病等[16]，而關于由擬盤多毛孢引起的澳洲堅果葉斑病的研究報道較少。本研究根據其形態學特征和rDNA-ITS 及TUB 序列鑒定出的引起澳洲堅果葉枯病的致病菌—小孢擬盤多毛孢菌P.microspora 與蔣桂芝等[17] 報道的結果一致，本研究還從多基因方面對此結果進行了補充論證。此次確定的致病菌污斑新擬盤多毛孢N.foedans，國內外對該病原菌的研究報道較少，此前更未見到有關研究者在澳洲堅果上發現此種病原菌的報道。本研究明確了澳洲堅果葉部病害的致病菌為小孢擬盤多毛孢P.microspora 及污斑新擬盤多毛孢N. foedans，但對這2 種致病菌是否存在復合侵染情況還未確定，對此問題尚需進一步研究，以明確其相互關系。

拮抗菌的篩選是生物防治研究的基礎性工作。

嚴冬等[18] 報道，從樟葉越桔嫩枝中分離的20 株內生真菌對3 種木腐菌及鐮刀孢、灰葡萄孢、鏈格孢的植物病原真菌均有較好的拮抗作用。在生防菌中最具有代表地位的當屬木霉菌一類，這是自然界中分布很廣且有較高生防價值的一類真菌，主要包括哈茨木霉、深綠木霉、短密木霉等，此類真菌至少對20 余種病原真菌、細菌有拮抗作用[19-20]。李瓊芳等[21] 研究發現，將哈茨木霉T23施用于中藥材種植田間，其對病蟲害的防效達到70%，與使用化學農藥的相比，施用哈茨木霉可使中藥材增產24.5% 以上。劉愛榮等[22] 研究發現，哈茨木霉對黃瓜尖孢鐮刀菌有顯著的抑制作用。

本研究用哈茨木霉與病原菌進行拮抗試驗，結果表明，哈茨木霉對澳洲堅果葉枯病多數病原菌都具有明顯的抑菌效果，用此方法來抑制澳洲堅果葉部病害的病原菌是可行的。本研究僅在室內實驗中證明了該生防菌對致病菌有明顯的抑制作用，但如果要將此方法運用到澳洲堅果經濟林中還需進行田間試驗，該生防菌在實際生產中能否起到有效防治作用，還有待驗證。目前市場中已有各種類型的微生物菌劑，其中以哈茨木霉為主導的生物農藥已得到廣泛使用，故將哈茨木霉運用于澳洲堅果生產中將是切實可行且行之有效的。

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[ 本文編校：伍敏濤]