初始酸堿度對龍眼酒釀造過程中有機酸變化規律的研究

鄧紅梅，溫兆毅，柳鏡炬，王 春

（廣東石油化工學院生物與食品工程學院，廣東省嶺南特色果蔬加工及應用工程技術研究中心，廣東茂名 525000）

龍眼是茂名等岒南地區特色的水果之一，其果肉營養豐富，有滋補強體、補益心脾、養血安神、益智寧心等多種功效。龍眼果肉含糖高達20 %，風味好，具有很高的營養價值，因此龍眼是釀造果酒的優質原料[1]。以龍眼為原料，低溫發酵，陳釀而成的發酵果酒，具有益氣補血、安神定志、降脂護心、延緩衰老等保健功能[2]。龍眼果酒中，富含維生素、有機酸及含氮物質，其中有機酸具有抑菌、抗病毒、增加冠脈流量、抑制腦組織脂質過氧化物生成、消炎和抗癌等作用，是果酒中主要的呈味物質。有機酸含量高低與果酒的品質和藥用價值有著極其密切的關系[3-7]。本課題組之前研究了不同初始糖度條件下，龍眼酒發酵過程中有機酸成分和含量的變化規律[6]，本實驗利用高效液相色譜法分析不同初始酸堿度對龍眼酒發酵過程中有機酸動態變化規律的影響，找到口感最佳的發酵條件，為龍眼酒釀造過程中有機酸的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：龍眼品種為石硤，購于茂名農貿市場；高活性干酵母，安琪酵母股分有限公司。

試劑及耗材：蔗糖、果膠酶、偏重亞硫酸鉀為食品級，磷酸二氫鉀、草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、草乙酸為標準品，甲醇為色譜純。

儀器設備：LC20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；BSP-250 恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；BCD-246WTM(E) 美的冰箱，合肥美的電冰箱有限公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋、80-2電動離心機，常州澳華儀器有限公司；RE-3000旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；JA1003 電子分析天平，上海上天精密儀器有限公司；WZ 系列手持折光糖度計，上海聚亮光學儀器有限公司；RHWN-25OeATC手持折光酒度計，漳州市新奧光電儀器有限公司；UV5500PC 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍眼酒釀造工藝

龍眼→分選→清洗→去殼去核→攪碎→加果膠酶酶解→過濾除渣→成分調節→加活化后的果酒酵母→前發酵→澄清、換罐→后發酵→成品→檢測

1.2.2 操作要點

（1）挑選新鮮完整的龍眼去殼去核獲得石硤龍眼2500 g，加入偏重亞硫酸鉀1.25 g，防止果肉氧化。

（2）攪碎時按果肉∶超純水的體積比=3∶1 的比例加入超純水800 mL，按果肉∶檸檬酸的質量比=5000∶1 的比例加入檸檬酸0.5 g，按果肉∶果膠酶的質量比=1250∶1 的比例加入果膠酶2.0 g 處理3 h，攪碎完成后，將果汁過濾裝入5 L玻璃發酵罐中。

（3）添加檸檬酸調整pH 值分別為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2 五個初始酸堿度（pH）梯度，進行二組平行實驗。按果肉∶酵母的質量比=50000∶7 的比例加入活化酵母菌0.35 g，22%蔗糖，在20 ℃下進行發酵。7 d后過濾除渣、換罐、封閉進行后發酵。

（4）在發酵前取果汁，第7 天龍眼酒的主發酵基本完成時取酒樣；第14 天、第21 天、第28 天以及第35 天龍眼酒發酵完成時取酒樣，研究8 種有機酸在發酵過程中的含量變化。

1.2.3 龍眼酒中有機酸含量的測定

樣品處理及色譜條件均與文獻[6]相同。

2 結果與分析

2.1 有機酸標準曲線及色譜圖

以不同濃度的有機酸為橫坐標，以峰面積為縱坐標，做標準曲線，得出線性回歸方程和相關系數R2，如表1所示。

由表1 可知，8 種有機酸標準曲線相關系數R2＞0.999，表明高效液相色譜法（HPLC）可以用于果酒中有機酸的測定，測定結果準確度高。

表1 有機酸標準曲線回歸方程和相關系數

2.2 不同初始酸堿度（pH）龍眼酒發酵過程中8 種有機酸含量的變化

以有機酸含量為縱坐標，發酵時間（果汁定為0）為橫坐標，用Origin Pro 8 軟件做出龍眼酒發酵過程有機酸含量變化。

從圖1—圖5 可知，在不同初始酸堿度條件下，龍眼酒發酵過程中8 種有機酸的變化有相似性。在主發酵期間（前7 d），酒石酸、蘋果酸含量明顯下降，乳酸、檸檬酸、琥珀酸含量明顯增加；發酵28～35 d，草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸最終含量均比果汁中含量低；草酸、α-酮戊二酸含量變化不大，一直保持緩慢下降趨勢，草乙酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸的最終含量比果汁中含量有所提高。

圖1 初始pH 3.0發酵過程有機酸含量變化

圖2 初始pH 3.3發酵過程有機酸含量變化

圖3 初始pH 3.6發酵過程有機酸含量變化

圖4 初始pH 3.9發酵過程有機酸含量變化

圖5 初始pH 4.2發酵過程有機酸含量變化

經過35 d 的發酵與陳釀，不同初始酸堿度釀造的龍眼果酒中8 種有機酸與龍眼果汁中的有機酸比較可得出變化規律，見表2。

果汁和果酒中的有機酸是非常重要的一類化合物，有機酸的含量以及分布顯示了果汁和果酒的感官質量(包括風味、顏色和香氣)、穩定性和微生物活動狀況等[8]。有機酸在不同的果酒中，甚至是同種水果不同發酵工藝釀制的果酒，種類及含量均存在較大差異，導致不同果酒風味各異[6，7-9，10]。發酵過程酵母的代謝包括酒精發酵、乙酸或蘋果酸-乳酸發酵。酵母代謝離不開酶，酶活性又受pH 值的影響，pH 值過高或者過低都會使酶活性降低或失活，只有在最適pH 值，酶活性才能最高。酶活性高低會直接影響產物（包括有機酸）含量變化。

由表2 可知，經過35 d 發酵與陳釀后，不同初始酸堿度對8 種有機酸的影響有差異。草酸在整個發酵過程含量（相對果汁）都是下降的，不同pH間含量變化不大，即受初始酸堿度的影響很小；初始酸堿度pH≤3.9 時酒石酸在各初始酸堿度間含量下降幅度變化不大，在21 %～23 %之間，當pH4.2時，降低幅度達41.07%，說明龍眼酒中可能存在酒石酸的解離平衡，初始酸堿度增加，有利于酒石酸解離，酒石酸根離子增加，與其中的陽離子結合形成酒石酸鹽；檸檬酸含量隨著初始酸堿度的增加而減少；乳酸和蘋果酸的含量隨著初始酸堿度的增加而增加。主要原因是由于不同pH 值對代謝途徑中酶活性的影響不同。

本實驗研究了pH 值為3.0、3.3、3.6、3.9、4.2 五個初始酸堿度梯度，在20 ℃下低溫發酵釀造龍眼酒，通過對龍眼酒色澤、香氣、酒體、風味進行評價，一致認為初始pH3.6～3.9 發酵釀制的龍眼酒品質最佳。

2.3 pH3.9時龍眼酒有機酸含量動態變化規律

8種有機酸標準色譜圖見圖6，pH 3.9時龍眼酒發酵過程中8種有機酸的色譜圖見圖7—圖11。

圖6 標準溶液色譜圖

圖7 pH 3.9發酵第7天色譜圖

圖8 pH 3.9發酵第14天色譜圖

圖9 pH 3.9發酵第21天色譜圖

圖10 pH 3.9發酵第28天色譜圖

圖11 pH 3.9發酵第35天色譜圖

通過對各有機酸峰面積計算得到初始酸堿度pH3.9時石峽龍眼酒有機酸含量變化，見表3。

由表3 可知，不同發酵時期8 種有機酸的總量均比原果汁高，發酵前7 d有機酸變化最明顯，其余時期基本上是平穩變化。表明發酵過程中有機酸的增加與發酵同步，這對果酒的風味及維持酸性環境抑制有害細菌達到長久儲存的目的是有益的，與之前研究不同初始糖度對龍眼酒釀造過程中有機酸變化規律相似[6]。在整個發酵與陳釀過程中，草酸、酒石酸和蘋果酸含量均比原果汁下降，草酸、酒石酸含量變化主要是由于形成了相應的草酸鹽和酒石酸鹽，同時，酒石酸也能被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸。酒石酸的含量先降后升，可能是伴隨發酵產生的各種代謝物會引起發酵液中pH 變化，影響酒石酸鹽的穩定性，導致酒石酸含量的變化。乳酸是龍眼汁和龍眼酒中含量最大的有機酸，在發酵過程中，乳酸處于積累的過程，與此同時，蘋果酸則表現出消耗的過程，是由于發酵時一直存在著能生成乳酸的代謝途徑——蘋果酸-乳酸發酵[11]。草乙酸、琥珀酸和檸檬酸的含量在主發酵（7 d 前）均比原果汁明顯上升，隨著發酵的繼續，含量變化趨于穩定。琥珀酸主要來自糖分子的發酵作用，是酒精發酵的正常發酵產物，少量來自于果汁中谷氨酸的變化，谷氨酸存在時，琥珀酸積累增多[12-13]。由于蘋果酸、酒石酸含量的減少，乳酸、琥珀酸含量的增加，使龍眼酒的口感變得更加柔順細膩、潤滑和醇厚[6，14]。

表3 初始酸堿度pH 3.9時龍眼酒各時期有機酸的含量

酸類是形成酒香味的主要物質之一，酒中缺乏酸會使酒顯得不柔和、不協調。酸類是形成酯類的前體物質，還可以構成其他香味成分。適量的酸在酒中能起到緩沖作用，消除口味的不協調，促進酒的甜味感。初始酸堿度pH3.9 釀制的龍眼酒中主要的有機酸是乳酸（7178.5 mg/L）、琥珀酸（2900.6 mg/L）、蘋果酸（2611.7 mg/L）、檸檬酸（2365.8 mg/L），其次是酒石酸（1272.5 mg/L）和草乙酸（1125.5 mg/L），還有少量的草酸（125.1 mg/L）、α-酮戊二酸（288.4 mg/L）。乳酸是一種略帶酸味的一元弱酸，能使果酒口感柔和、圓潤；琥珀酸具有酸味及輕微的咸味和苦味，易溶于酒，使酒味調和，最具有味覺特征，可使酒的味道濃重，增加醇厚感[15]。

3 結論

在不同初始酸堿度條件下，龍眼酒發酵過程中8 種有機酸的變化有相似性。在發酵前7 d，酒石酸、蘋果酸含量明顯下降，乳酸、檸檬酸、琥珀酸含量明顯增加；發酵第28～35 d，草酸、酒石酸、蘋果酸、α-酮戊二酸最終含量均比果汁中低；草酸、α-酮戊二酸含量變化不大，一直保持緩慢下降趨勢；草乙酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸的最終含量比果汁中含量高。經過35 d 發酵與陳釀后，不同的初始酸堿度對8 種有機酸的影響是有差異的。草酸在整個發酵過程含量（相對果汁）都是下降的，不同pH間含量變化不大，即受初始酸堿度的影響很??；初始酸堿度pH≤3.9 時酒石酸在各初始酸堿間含量下降幅度變化不大，但在初始酸堿度pH4.2 時，降低的含量是其他初始酸堿度的近一倍；蘋果酸初始酸堿度pH≤3.6 時降低的含量相當于pH＞3.6 時的1倍；檸檬酸含量隨著初始pH 的增加而減少；乳酸含量隨著初始pH的增加而增加。

在pH 3.9 條件下，不同發酵時期8 種有機酸的總和均比原果汁高，其中發酵前7 d 有機酸變化最明顯，其余時期基本上平穩變化。在整個發酵與陳釀過程中，草酸、酒石酸和蘋果酸含量均比原果汁明顯下降；草乙酸、琥珀酸和檸檬酸的含量在主發酵（7 d 前）時均比原果汁明顯上升，隨著發酵的繼續，含量變化趨于穩定。主要的有機酸是乳酸（7178.5 mg/L）、琥珀酸（2900.6 mg/L）、蘋果酸（2611.7 mg/L）、檸檬酸（2365.8 mg/L），其次是酒石酸（1272.5 mg/L）和草乙酸（1125.5 mg/L），還有少量的草酸（125.1m g/L）、α-酮戊二酸（288.4 mg/L），各種有機酸相互調和使龍眼酒風味獨特。