基于高通量測序對不同陳放時間大曲細菌群落特征研究

李朝云，唐平華，羅 平，付宇豪，曾祥衛，佘露露*

(1.仁懷醬香白酒科研所，貴州遵義 564500；2.貴州茅臺鎮北街酒廠(集團)有限責任公司，貴州遵義 564500)

醬香白酒是中國特有的一種高度蒸餾酒，生產過程中采用高溫制曲工藝，使其富集了大量的微生物和酶系[1]。在發酵前期積累和富集大量的香味物質，在陳放過程中，大曲繼續網羅空氣和環境中的微生物使其微生物群落更加豐富，微生物菌群在整個發酵過程不斷演替，充分利用高粱和大曲中的各類物質，形成醇厚豐滿的醬香型白酒基酒[2-4]。大曲作為釀酒糖化劑，主要是提供多樣的微生物用于產酒和風味物質的產生[5]，同時補充了生產過程中的淀粉含量，有利于提高白酒產量[6]。分析大曲微生物的多樣性，可以更好的了解大曲中的微生物種類和數量，為酒類風味物質的形成和微生物的選育提供理論依據[7]。

第二代高通量測序技術可以更加精確、快速的分析樣品中微生物結構，成為白酒生產過程中微生物菌群研究的主要手段[8]。在制曲中，發酵初期曲塊處于常溫狀態，適宜酵母大量增殖，在發酵過程中，溫度逐漸升高，酵母菌生長被抑制，在發酵中后期僅能少量或不能檢出酵母，但是可檢出大量細菌和霉菌等[9]；在堆積過程中，初期主要是酵母的富集過程，在堆積前后酵母數量明顯增加，且增加幅度有1～3 個數量級，增加幅度因堆積輪次和車間不同而略有差異[10-12]。

仁懷產區現階段對醬香白酒生產工藝已經建立較完整的團體標準，但未從醬香白酒生產過程微生物菌落演替方面詮釋醬香白酒生產過程中風味物質的產生和積累。探明大曲中微生物的種類和數量，是探究醬香白酒風味形成不可或缺的一部分。以陳放1 個月、4 個月、6 個月的大曲為研究對象，探究陳放不同時間大曲中的菌群結構，為后續探究醬香白酒風味形成夯實基礎，對仁懷醬香型白酒產業的發展具有重要的意義，并為地方產業的推進及進步提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：1 個月、4 個月、6 個月黃曲、黑曲、白曲分別命名為：XH、XK、XB、FH、FK、FB、SH、SK、SB，大曲樣品來自貴州茅臺鎮北街酒廠(集團)有限責任公司曲房陳放大曲，將所得大曲粉碎后用四分法進行縮分取樣、備用。

試劑：試劑盒Illmina 公司Hiseq Rapid SBS Kit v2(FC-402-4023 500 Cycle)等。

儀器設備：PCR 擴增儀（2720），美國應用生物系統公司；電泳儀（DYY-6C），北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統（BG-gdsAUTO(130)），北京百晶生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

醬香大曲樣品由四川帕諾米克生物科技有限公司測序，PE250 測序方式，采用Qiagen Powersoil pro 試劑盒提取黃曲、黑曲和白曲樣品中的DNA。在細菌16S rDNA V4 區域進行擴增，擴增引物Primer5'-3'：515F (5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），PCR 擴增用酶為TOYOBO KO EPlus-Neo DNA Polymerase（KOD-401B），擴增體系為50μL：5 μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo，5 μL 2 mmol/L dNTPS，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL 上游 引 物U515F，1.5 μL 下 游 引 物U806R，1 μL KOD-Plus-Neo(1U/μL)，2 μL DNA 模板，31 μL 超純水。PCR 擴增反應條件為預變性94 ℃1 min，1個循環；變性94 ℃20 s，退火54 ℃30 s 和延伸72 ℃30 s，25～30 個循環；72 ℃5 min，1 個循環；4 ℃保溫。每個樣本進行3 次PCR 技術重復，取線性期PCR 產物等量混合后用于后續建庫[13]。

擴增產物純化后用2%的瓊脂糖凝膠，每個樣本進行3 次重復，取線性期PCR 產物等量混合后用NEW ENGLAND BioLabs 公司NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina 建庫。進一步在Illumina HiSeq 2500測序平臺開展高通量測序。

1.3 數據處理與分析

高通量測序所得序列通過FLASH 拼接雙端序列、過濾去除低質量序列，基于Uchime 算法和gold數據庫去除嵌合體，得到有效數據Effiective Tag。基于Usearch 軟件，使用UPARSE 算法在97 %的一致性水平上進行Operational Taxonomic Unit（OUT）聚類。基于UCLUST 分類法與SILVA 數據庫進行基因序列比對和注釋分析。使用R 語言和ggplot2包作圖。

2 結果與分析

2.1 α多樣性分析

通過Usearch 算法在97 %的一致性水平上進行OTU 聚類。計算Chao 指數和ACE 指數（以確定物種豐富度）、Shannon 指數和Simpson 指數（以確定物種多樣性）及檢測到的物種數目，以描述樣品中的細菌菌群多樣性，分析測序指數結果見表1。

表1 大曲細菌群落α多樣性指數

隨著樣本測序深度的增加，各大曲樣品的真菌測序Shannon 指數和Simpson 指數都呈現逐漸平緩的變化趨勢，說明測序數據結果已經覆蓋絕大部分真菌，測序數據量合理、測序深度足夠。可以看出隨著大曲陳放時間延長，大曲中真菌多樣性呈增長趨勢，各個樣品的Coverage 指數均達到了99.99 %以上，說明在此條件下的測序數據結果完全能夠反映所測樣本中真菌的真實情況，絕大部分的微生物種系類型都被檢測到，在此基礎上可以進行后續的研究分析。

2.2 物種組成結構分析

根據分類學分析結果，可以得知不同分組在各分類水平上的群落結構組成情況。根據群落柱形圖，可以直觀看出各樣本在某一分類學水平上主要包括的微生物和樣本中各微生物的相對豐度。

圖2 門水平上細菌物種豐度組成

群落柱形圖表明，樣品中共檢出10 個菌門，其中硬壁菌門（Firmicutes）是白曲中的第一優勢菌門，在1 個月、4 個月和6 個月大曲中分別占總微生物93.61 %、92.05 %、92.61 %，Firmicutes 在XH 和FH 中含量分別為83.06 %、89.26 %，在SH 中含量降低到18.52 %，Firmicutes 在黑曲中含量分別為49.59 %、37.62 %、79.90 %；放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門(Proteobacteria)在XB、FB、SB 中含量無較大變化，在XH、FH、SH 中均呈現先減少后增大的情況，在FH 中Actinobacteria 和Proteobacteria分別占總微生物26.01 %，44.13 %；Actinobacteria在黑曲中含量先增加后減少，Proteobacteria 變化趨勢相反，但最終含量均保持在10 %以內；Bacteroidetes 在SH 中占比超過1 %，其余菌門含量均低于0.5%。上述結果與已報道的醬香大曲微生物在門類結構上具有相似性[14-15]，郭敏[16]對醬香大曲制曲中微生物多樣性檢測發現在大曲制作過程中優勢菌門是Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria；Zhang 等[17]對清香型白酒釀造用大曲細菌組成及多樣性研究發現細菌主要為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Cyanobacteria、Chloroplast(藍藻菌門)，其中Firmicutes 為優勢菌門；樊建輝等[18]研究仰韶陶融型白酒釀造用大曲可培養微生物的多樣性，結果表明Firmicutes 和Proteobacteria 為優勢菌門；王曉丹等[19]從醬香大曲樣品中共檢出細菌6個菌門，主要為Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria 等，并發現傳統與機械大曲中所檢出的微生物，在門水平上兩種制曲所生產曲胚中細菌的生態多樣性變化規律相似。

利用高通量測序方法從9 例大曲中共檢出109個菌屬，由圖3 可知，枝芽胞桿菌屬（Virgibacillus）是在9 例大曲中含量均超過10 %的菌屬，在SB 中含量最高，達到總含量的35.74 %，但是在SH 中含量僅有3.42%；克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）新曲中含量均高于12 %，隨著陳放過程，從XB 中的12.03 %提高到SB 中30.86 %，但在黃曲中的含量變趨勢正好相反，從XH中的32.11%，到SH含量僅3.52 %，黑曲中含量無明顯線性關系；糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）在白曲陳放過程中期含量基本保持不變，在FK 中含量高達52.44 %，是所有樣品中菌屬含量最高的；葡萄球菌屬（Staphylococcus）在FH 中含量達到13.45 %，Oceanobacillus（海洋芽孢桿菌屬）在XB 中含量達到21.90 %，其余各類菌屬含量均低于10 %；高溫放線菌屬(Thermoactionmyces)表現出分布廣泛、耐受溫度高、生長速度快的特點，具有重要的潛在應用價值和意義，是現階段醬香大曲高溫制曲的重要研究菌種，有研究從高溫放線菌中提取分離高溫酶如α-高溫淀粉酶、纖維素酶、幾丁質酶等應用于大分子物質的分解[20-23]。

圖3 屬水平上細菌物種豐度組成

根據大曲種類，在屬水平對其分析得到，在1個月、4 個月、6 個月大曲中分別檢出155 個、103個、225 個屬，其中共有的有71 個屬，分別單獨含有的有41 個、6 個、99 個屬，數據顯示，在屬水平上分析大曲在陳放過程中，屬水平上數量先減少后增加，6 個月陳曲中屬種類最多，這可能是大曲在陳放過程中網羅空氣和環境中的微生物以豐富自身微生物種類使得微生物菌群更加豐富[24-25]。

2.3 通過LEFse分析組間菌群差異

在醬香高溫制曲過程，通過LEfSe 分析探究不同陳放時間下大曲細菌微生態結構中物種的差異性，可以揭示制曲過程微生物結構特征和發酵、風味動力關鍵調控因子，有利于調控曲胚發酵參數和提升曲胚發酵質量。

圖4 大曲屬水平物種韋恩圖

由圖5 可以看出，在屬水平上新曲中新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）為顯著富集的差異物種，在發酵過程中可由碳水化合物氧化產酸但不能發酵產酸，現階段該菌株研究較少，是一種亟待開發的菌屬[26-27]；4 個月大曲中Staphylococcus是顯著富集的差異物種，Staphylococcus是革蘭氏陽性球菌且多數為非致病菌，Thermoactionmyces也是顯著富集的差異物種[28-29]，Thermoactionmyces大都適宜在高溫下生活，表現出分布廣泛、耐受溫度高、生長速度快的特點，具有重要的潛在應用價值和意義[21]。從高溫放線菌中提取分離高溫酶如α-高溫淀粉酶、纖維素酶、幾丁質酶等應用于大分子物質的分解[20]，也有研究表明高溫放線菌在醬香大曲細菌的相對含量占34.40%，運用PCR-DGGE 技術對醬香型和芝麻香型高溫大曲中細菌群落結構進行分析研究，均發現高溫放線菌的存在[30]，羅小葉等[21]以醬香型大曲為實驗原材料，從茅臺大曲中分離純化5 株具有高溫放線菌菌落形態特征的菌株，分別有3 株嗜溫高溫放線菌（Thermoactinomyces thalpohillus）、1 株甘蔗高溫放線菌（Thermoactinomyces sacchari)、1 株高溫放線糖萊斯菌（Laceyella sacchari），同時發現高溫放線菌產生的水解酶對釀酒原料的分解及促進風味物質代謝產生具有一定的作用。在6 個月大曲中乳球菌屬(Lactococcus)為顯著富集的差異物種，這一類細菌為革蘭氏陽性屬化能自養型微生物，以碳水化合物發酵產酸，L(+)-乳酸為主，不產氣，可能是白酒中乳酸的主要來源[31]。

圖5 大曲LEFse差異分析圖

2.4 PCA分析

PCA 是對多維數據進行降維處理，以此提取數據中最主要的因素，發現復雜數據的規律。在PCA分析中，樣品的菌群越相似，則兩個樣品距離越近。

在圖6 中，橫坐標對差異影響貢獻率為70.05 %，縱坐標對差異影響的貢獻率為22.77 %。部分1 個月、4 個月、6 個月大曲距離很近，菌群相似，但是還是明顯看出各類大曲樣品并沒有聚集在一起，這說明1個月、4個月、6個月大曲微生物構成差異較大。

圖6 大曲PCA分析圖

2.5 PCoA分析

PCoA 是根據特征值和特征向量排序從多維數據中提取出主要的元素和結構，選取貢獻量最大的主坐標組合作圖。兩個樣品的菌群組成越相似，兩個樣品距離越近。

在圖7 中，PCoA 的橫坐標對差異影響貢獻率為48.82 %，縱坐標對差異影響的貢獻率為16.66 %。通過基于Unweighted Unifrac 距離計算的PCoA，可以發現除4 個月大曲明顯聚集在一起外，新曲和6 個月大曲樣品距離較遠，沒有明顯聚集的表現。

圖7 大曲PCoA分析圖

2.6 UPGMA聚類樹

在微生物生態研究當中，UPGMA 分類樹可以用于研究樣本間的相似性，越相似的樣本擁有越短的共同分支。如圖8 所示，各個大曲樣本除XK 和FK、XB 和SK 菌群組成相似外，其余大曲樣本均無明顯相似性，UPGMA 聚類樹和樣本屬水平上的物種豐度聚類圖結果與PCoA分析結果相似。

圖8 樣本間Beta多樣指數UPGMA聚類圖

3 結論

對北街酒廠陳放不同時間的9 例大曲細菌結構多樣性進行研究，分別鑒定出10 個菌門和109 個菌屬，通過對不同陳放時間大曲細菌多樣性研究分析，明確Firmicutes 在白曲中為第一優勢菌門，Actinobacteria、Proteobacteria 是僅次于Firmicutes 的兩個菌門；Virgibacillus是大曲中的重要菌屬，占微生物比例均超過10 %，Kroppenstedtia、Saccharopolyspora都屬于大曲中優勢菌屬；對不同陳放時間的大曲差異性分析發現，在1個月、4個月、6個月大曲分別檢出155 個、103 個、225 個屬，其中共有的有71個屬，分別單獨含有的有41 個、6 個、99 個屬，表明大曲在陳放過程中網羅了環境中的微生物使得大曲微生物菌群更加豐富，側面印證了環境微生態會通過影響大曲微生物多樣性進而影響醬香白酒的釀造，環境微生物是醬香白酒釀造不可或缺的微生物組成部分，大曲通過品溫上升的篩選，最終實現環境、原料等外界中的有益菌向大曲遷移和富集；發現新曲中Novosphingobium為顯著富集的差異物種，4個月大曲中Staphylococcus和Thermoactionmyces為顯著富集的差異物種，6個月大曲中Lactococcus為顯著富集的差異物種。這是大曲在開放式發酵條件下形成的具有標志性的菌群結構，或可成為大曲陳放時間鑒別的主要依據，對大曲PCA 和PCoA分析發現1個月、4個月、6個月大曲微生物構成差異較大。UPGMA 聚類樹分析和大曲屬水平上的物種豐度聚類圖分析結果再一次印證不同存放時間大曲樣本均無明顯相似性。大曲提供了醬香白酒釀造過程主要的酶、氨基酸、糖等發酵前體物質，是醬香型白酒生產的“骨架”。所以，探究不同陳放時間大曲的微生物結構特征為醬香型白酒風味物質的產生提供了理論依據，同時為大曲中特征微生物的分離篩選培養提供數據支撐，從微生物角度詮釋了高溫大曲陳放過程是醬香白酒不可分割的釀造工藝。

圖9 樣本屬水平上的物種豐度聚類圖