順苯磺酸阿曲庫銨（51w89）作為CD73 抑制劑的發現及評價

劉永杰，湯姜楊，朱麗麗，李洪林

（華東理工大學藥學院, 上海市新藥設計重點實驗室, 上海 200237）

胞外5′-核苷酸酶(e5NT，又稱CD73)，由NT5E基因編碼，蛋白分子量為70 kDa，被糖基磷脂酰肌醇(GPI)固定在細胞表面[1-3]。CD73 與CD39 共同參與嘌呤能信號的調控，在嘌呤能信號通路中，三磷酸腺苷（ATP）/二磷酸腺苷（ADP）被CD39 水解為單磷酸腺苷（AMP），AMP 被CD73 水解為腺苷和磷酸，AMP轉化為腺苷在細胞外不可逆[4]。在腫瘤微環境中，CD73 的過表達與腫瘤細胞的免疫逃逸有關。CD73 在腫瘤細胞、樹突狀細胞(DCs)、調節性T (T reg)細胞、骨髓源性抑制細胞(MDSCs)、自然殺傷細胞(NK)和腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)的細胞表面均有表達[5]。CD73 的表達受缺氧誘導因子-1 (HIF-1)、TGF-β、EGFR、AKT、β-catenin等分子的調控，特別是受HIF-1[6-10]的調控尤為突出。缺氧是腫瘤微環境的一個重要特征，缺氧誘導HIF-1 上調，進而導致腫瘤微環境中CD73 的廣泛表達。放化療引起的缺氧或ATP 富集會促進CD39-CD73-腺苷信號的級聯反應，有利于增強腫瘤細胞的增殖和功能，促進腫瘤免疫逃逸[11]。因此，CD73 被認為是一個重要的腫瘤免疫治療潛在靶點。

由于CD73 與腫瘤發生、發展以及擴散之間的關系，全球眾多醫藥企業和科研單位都在積極開發靶向CD73 的單克隆抗體和小分子抑制劑。目前，代謝穩定的核苷酸類似物是CD73 小分子抑制劑研發的主流[12]。1970 年，核苷酸類似物AMPCP (抑制常數Ki=88.4 nmol/L)首次被報道具有強效的CD73 抑制活性[13]。文獻[14-16]報道了活性更強的核酸類似物PSB-12379 (Ki=2.2 nmol/L)、PSB-12489 (Ki=0.31 nmol/L)，處于臨床研究中的CD73 抑制劑AB680 (Ki=5 pmol/L)也屬于核酸類似物[17]。雖然這類化合物具有強效的CD73 抑制活性，但是由于酸性太大，影響其成藥性。此外，一些非核苷酸類CD73抑制劑也被報道，主要包括黃酮類化合物[18]、磺胺類化合物[19]、蒽醌類化合物[20]和苯并噻嗪類化合物[21]，但這些化合物表現出比較弱的活性或潛在的代謝問題。2020 年文獻[22]報道了一類新型高活性、具有選擇性的CD73非核苷酸抑制劑，這類化合物因避免了CD73 核苷類抑制劑酸度大、透膜性低等缺點，從而性能得以提高。

本文對實驗室保存的876 個已經上市的藥物開展靶向CD73 的篩選，發現順苯磺酸阿曲庫銨（51w89）可以抑制CD73 的酶活性，為研發CD73 小分子抑制劑提供了新的苗頭化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蛋白與細胞 CD73 蛋白由本實驗室根據文獻[2]純化得到，MDA-MB-231、MCF-7、Wi-38 細胞來源于ATCC 細胞庫。

1.1.2試劑 孔雀綠試劑盒購自BioAssaySystems（POMG-25H）；CD73siRNA 購自廣州銳博生物科技有限公司（siG000004907A）；Lipo6000轉染試劑購自Beyotime（C0526）；CD73 抗體（CD73RabbitPolyclonal antibody）購自Proteintech（12231-1-AP）；GAPDH 抗體（GAPDH Mouse mAb）購自Abclonal（AC002）；Goat-anti-MouseSecondaryantibody 購自SAB 抗體公司（L3032）；Goat-anti-RabbitSecondaryantibody 購自SAB 抗體公司（L3042）；氨基偶聯試劑盒、醋酸鈉緩沖液（pH4.5）和CM5 芯片購自GEHealthcare；RIPA裂解液購自武漢塞維爾生物科技有限公司（G2002）；BCA（BicinchoninicAcidAssary）試劑盒購自BioSharp（BL521A）；BSA 購自源葉生物（9048-46-8）；結晶紫染色液購自Beyotime（C0121）；Matrigel 基質膠購自康寧公司（354248）；T 細胞擴增培養基購自Sigma 公司（S1694）；CD3/CD28 抗體購自Stemcell（10971）；IFN-γELISA檢測試劑盒購自聯科生物（EK180-48）；CD8+T 細胞磁珠分選試劑盒購自Biolegend（480011）；腺苷5′-(α,β-亞甲基)二磷酸APCP（CAS號:3768-14-7）、51w89（CAS 號：96946-42-8）以及AMP（CAS 號：130-49-4）購自Sigma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1分子水平CD73 活性測試 將重組CD73 蛋白用測活緩沖液（1mmol/LCaCl2,1mmol/LMgCl2,200mmol/L NaCl,10mmol/LKCl,100mmol/LTris-HCl,pH=8.0）稀釋至10ng/mL，在96 孔板中加入70μLCD73 蛋白稀釋液，然后加入化合物二甲基亞砜（DMSO，體積分數控制在0.5%），吹打均勻后室溫孵育10min，加入AMP 使其終濃度為15μmol/L，然后放至37℃烘箱中孵育30min 后，加入孔雀綠試劑置于室溫顯色30min，待顏色穩定后使用酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，Synergy2）檢測630nm 的吸光度值。每個實驗條件設3 個復孔，使用GraphPadPrism7.0 軟件擬合化合物的IC50值。

1.2.251w89 與CD73 蛋白結合親和力的測定 采用表面等離子體共振（SurfacePlasmonResonance，SPR）技術測定化合物51w89 與CD73 蛋白之間的結合親和力。SPR 實驗是在Cytiva（思拓凡）公司的BIAcore T200 儀器上進行。首先將純化后的CD73蛋白用pH 4.5 的醋酸鈉溶液稀釋至75 μg/mL，再用偶聯試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）將CD73 蛋白偶聯在CM5 芯片上，流速為10 μL/min，結合時間為600 s，最后用乙醇胺封閉，最終CD73 偶聯量約為4946 RU。偶聯完成后，利用運行緩沖液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）,2.7 mmol/L KCl, 137 mmol/L NaCl 和φ=0.005%表面活性劑P20, pH 7.4）沖洗芯片表面直至基線平穩，之后將51w89 用運行緩沖液溶解，并且成倍稀釋成一系列濃度梯度（1.563、3.125、6.250、12.500、25.000 μmol/L），以30 μL/min 的流速，結合90 s，解離120 s。實驗結果利用BIAcore T200 Evaluation 1.0 軟件進行穩態擬合。

1.2.3Westernblot 檢測CD73 在腫瘤細胞中的表達選取兩株人乳腺癌細胞（MDA-MB-231、MCF-7）以及一株人胚肺細胞（Wi-38）以每毫升5×104個細胞的密度鋪于6 孔板中，待密度和活力均達到90%以上時，用PBS 刮取清洗細胞并于放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液中孵育30min，離心去上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。樣品與5×loading 上樣緩沖液混勻，在100℃金屬浴中煮5min，接著對其進行10%SDS-PAGE 凝膠電泳并轉膜，將目的條帶剪下用5%BSA封閉1h 后，用CD73 抗體孵育并置于4℃過夜。用含TBST 緩沖液（Tris-HCl,NaCl，Tween 20）清洗3 遍，于室溫下孵育二抗2h，隨后用化學發光儀曝光條帶。

1.2.4細胞水平CD73 活性測試 當MDA-MB-231 的細胞密度達到90%、細胞活力達到95%及以上時，加入胰酶消化，將細胞懸液轉移至15mL無菌離心管中，在1000r/min 轉速下離心3min，棄去培養基，加入活性測試液（2mmol/LMgCl2，125mmol/LNaCl，1mmol/L KCl，10mmol/L葡萄糖，10mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）緩沖液,pH7.2）重懸細胞，然后在1000r/min轉速下離心3min，重復上述操作3 次。細胞計數后，用活性測試液稀釋細胞，在96 孔板中每孔加入70μL（約2500 個細胞）細胞懸液，然后加入化合物吹打均勻（DMSO 的體積分數控制在0.5%），置于37℃烘箱中孵育10min，加入底物AMP 使其終濃度為15μmol/L，然后加入孔雀綠試劑室溫顯色30min，待顏色穩定后使用BioTek 酶標儀檢測630nm 處的吸光度值。每個實驗條件下設3 個復孔，使用GraphPadPrism7.0軟件擬合化合物的IC50值。

1.2.5siRNA 干擾腫瘤細胞CD73 表達 將生長狀態良好的MDA-MB-231 消化后重懸，以每孔1×105個的細胞密度均勻鋪于6 孔板中，待6 孔板中的細胞生長融匯達50%以后，將CD73 siRNA 通過Lipo6000轉染到MDA-MB-231 細胞中，繼續培養3 d 后，通過Western blot 檢測CD73 表達情況。

1.2.6Transwell 實驗 設置空白組、陰性對照組（CD73-siRNA 組，敲除了CD73 的MDA-MB-231 細胞）以及加藥組（10μmol/L51w89），在Transwell 上室加入100μL 與上述對應的細胞及化合物，細胞密度為每毫升5×104個細胞，同時在下室加入φ=10%的胎牛血清培養基600μL。孵育24h 后，丟棄上室細胞，通過膜向下表面遷移的細胞用甲醇室溫固定15min，結晶紫染色15min，然后用PBS 清洗上室3遍。將小室放在載玻片上，選取至少3 個不同的視野，在顯微鏡（德國Leica 公司，LeicaDMil 型）下觀察并拍照。

1.2.7細胞劃痕實驗 將生長狀態良好的細胞MDAMB-231 正常消化后重懸，以每孔5×105個的細胞密度均勻鋪于6 孔板中，設置對照組、51w89 組(51w89濃度分別為5、10、50μmol/L)，然后將細胞轉移到培養箱中繼續培養。待6 孔板中的細胞生長融匯達到95%后，用10μL 的移液器吸頭垂直于底部劃痕，然后棄去原來的培養基，用PBS 漂洗3 次，洗去漂浮的細胞碎片。用無血清RMPI-1640 培養基將51w89依次稀釋為50、10、5μmol/L，并加入到相應的孔中，對照孔中只加入無血清的RMPI-1640 培養基。劃痕0、12、24、36h 后，選取至少3 個不同的視野，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8ELISA 法檢測T 細胞中IFN-γ的分泌水平收集健康志愿者的外周血，用磁珠分選試劑盒分出CD8+T 細胞，將CD8+T 細胞在完全生長培養基（1 mmol/L 谷氨酰胺，30 IU/mL IL-2 和25 μL/mL的CD3/CD28T 細胞激活劑）中培養24h，然后收集細胞，重懸在不含T 細胞激活劑的細胞擴增培養基中。將細胞以每孔8×104個細胞（90 μL）接種于96 孔板上，加入待測化合物，以1 μmol/L 腺苷5'-(α,β-亞甲基)二磷酸（APCP）作為對照，于37 ℃孵育15 min 后，除了空白對照組外均加入終濃度為25 μmol/L的 AMP，在37 ℃，φ=5% CO2條件下孵育96 h。每個實驗條件設3 個復孔。將96 孔板于300g條件下離心10 min，取上清，用ELISA 法檢測細胞因子含量。

2 實驗結果與分析

2.1 51w89 抑制重組蛋白CD73 的酶活性

以100 μmol/L 的化合物濃度對本課題組的老藥庫（包含876 個已經上市的藥物）進行初篩，可得到100 μmol/L 51w89 對重組蛋白CD73 的抑制率為93.30% (圖1(a)中紅色球)，然后設置不同濃度的51w89 測試其對CD73 的抑制活性，測得其分子水平的IC50為(13.30±0.34) μmol/L（圖1(b)）。

圖1 51w89 抑制重組蛋白CD73 的酶活性Fig.1 Inhibition activity of 51w89 against recombinant CD73

2.2 SPR 評價51w89 與重組蛋白CD73 的結合親和力

為了進一步驗證51w89 靶向結合CD73，采用SPR 技術評價51w89 與重組蛋白CD73 的結合親和力，得到其結合親和力系數（KD）為20.45 μmol/L（圖2）。

圖2 51w89 與重組CD73 蛋白結合的SPR 結果Fig.2 SPR results for the binding affinity between 51w89 and CD73

2.3 51w89 抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231 中CD73 的酶活性

51w89 對人乳腺癌細胞MDA-MB-231 的細胞毒性小（IC50= （71.43±1.19）μmol/L），且高表達CD73（圖3（a）），因此本文選擇MDA-MB-231 細胞用于后續細胞實驗。用孔雀綠試劑盒測試在MDA-MB-231 細胞中51w89 對CD73 的酶抑制活性，得到IC50為（17.70±0.98）μmol/L（圖3（b））。

2.4 Transwell 實驗測試51w89 抑制MDA-MB-231細胞的遷移能力

將CD73 siRNA 轉染到MDA-MB-231 細胞（即CD73-SiRNA 中后，通過Western blot 分析CD73 表達情況(圖4(a))，結果表明轉染CD73 siRNA 后，CD73 的表達量明顯降低。Transwell 實驗結果顯示，加入51w89 或siRNA下調CD73 表達后，穿膜細胞數少于對照組，即抑制了MDA-MB-231 細胞的遷移(圖4(b))。

圖4 51w89 或CD73-siRNA 對MDA-MB-231 細胞遷移能力的抑制效果Fig.4 Inhibitory effects of 51w89 or CD73-siRNA on the migration of MDA-MB-231 cells

2.5 劃痕實驗顯示51w89 抑制MDA-MB-231 細胞的遷移能力

劃痕實驗結果如圖5 所示，在沒有添加51w89的情況下（控制組），從0～36 h，劃痕隨著時間在逐漸修復，說明MDA-MB-231 細胞進行了遷移；而添加51w89的處理組，細胞的愈合能力較對照組減弱，而且隨著51w89濃度的增加，劃痕的愈合面積隨之減小，說明MDA-MB-231 細胞的遷移能力也逐漸受到抑制。該實驗結果表明51w89 抑制MDA-MB-231細胞的遷移活性。

圖5 51w89 抑制MDA-MB-231 細胞遷移的劃痕實驗Fig.5 Inhibitory effects of 51w89 on the migration of MDA-MB-231 cells by scratch tests

2.6 51w89 可以逆轉AMP 對CD8+T 細胞的抑制作用

腺苷信號傳導與免疫調節息息相關，腺苷濃度過高時會產生免疫抑制。AMP 可被CD73 水解為腺苷和磷酸，因此CD73 是腺苷產生過程中的限速分子。加入25 μmol/L 的 AMP 后，CD8+T 細胞分泌的炎癥細胞因子IFN-γ水平降低，而CD73 抑制劑APCP或51w89 可在一定程度上逆轉AMP 對CD8+T 細胞分泌IFN-γ的抑制作用（圖6）。

圖6 ELISA 法測定CD8+T 細胞分泌IFN-γ 的水平Fig.6 Measurements of IFN-γ secretion in CD8+T cells by ELISA

3 結 論

在腫瘤微環境中，腺苷是ATP 的代謝產物，是一種有效的免疫調節因子。CD73 在腫瘤細胞和免疫細胞上的過表達導致腫瘤微環境中腺苷的濃度升高，高濃度的腺苷抑制抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤細胞增殖、轉移和血管生成。CD73 是腺苷生成過程中的限速分子，因此，抗CD73 治療有望成為一種新的腫瘤免疫治療方法。

本文篩選發現51w89 對CD73 具有酶抑制活性，通過表面等離子體共振實驗驗證51w89 可靶向結合CD73。通過劃痕實驗、Transwell 實驗和siRNA實驗證明CD73 在腫瘤細胞遷移過程中的作用，表明51w89 可抑制MDA-MB-231 細胞的遷移能力。另外，證實51w89 可逆轉AMP 對CD8+T 細胞的抑制作用。因此，51w89 可被作為CD73 抑制劑苗頭化合物并用于后續的結構優化以及抗腫瘤研究。