EphB3 受體在乳腺癌中的表達及臨床意義

黃均慧，王 峰，王 華

（1 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 226001；南通大學(xué)附屬醫(yī)院2 甲乳外科，3 檢驗科）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率仍在不斷上升[1-2]。促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞激酶（erythropoietin producing hepatocytekinase,Eph）受體是受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase,RTK）家族的最大亞類,Eph 受體及其Ephrin 配體參與人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3]。已有研究表明,EphB3 在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和卵巢粘液性癌等腫瘤中異常表達[4-6]。本研究收集2015—2016年南通大學(xué)附屬醫(yī)院甲乳外科80 例乳腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本,測定乳腺癌組織及其癌旁組織中EphB3 受體表達水平,分析EphB3 受體與乳腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)以及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 女性乳腺癌患者80 例,均行乳腺癌改良根治手術(shù),術(shù)前未接受過其他抗腫瘤治療,經(jīng)病理證實為原發(fā)性腫瘤。手術(shù)切取乳腺癌組織及其周圍5 cm 處正常組織,隨即置于-80 °C 冰箱保存待測。本研究經(jīng)過南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

1.2 RNA 提取和濃度測定 組織標(biāo)本置于冰上,每例標(biāo)本約取50 mg,剪碎后放入EP 管中,加入1 mL Trizol 試劑（Invitrogen 公司,美國）和3 顆研磨珠,研磨機（KZ-III-F）研磨后移至新EP 管中,進行瞬時離心。加入0.2 mL 三氯甲烷,震蕩混勻后在4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。取最上層透明液體0.5 mL移至新EP 管中。加0.5 mL 異丙醇沉淀RNA,離心,保留白色膠狀沉淀。加入1 mL 75%酒精洗滌,再次4 ℃、7 500 r/min 離心10 min,留下白色沉淀。置于50 ℃烘箱中15 min,使白色沉淀變?yōu)橥该鳌＜尤?0 μL DEPC 水,再次于60 ℃烘箱中5 min,獲得RNA 原液。采用紫外線光譜儀測定RNA 濃度,置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄 提取的RNA 置于冰上,依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書依次添加各種試劑。采用C1000 基因擴增儀,25 °C 300 s,42 °C 3 600 s,70 °C 300 s,4°C至結(jié)束。結(jié)束后加入DEPC 水,將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 稀釋6 倍,震蕩搖勻后放入-80 °C 冰箱中保存。

1.4 實時熒光定量PCR 依次向八連管中加入熒光染料10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 8 μL,以U6 作為內(nèi)參,每例樣本設(shè)置3 個復(fù)孔。采用Cobas z 480 型全自動熒光PCR 分析儀（羅氏公司,瑞士）,反應(yīng)設(shè)置：95 °C 10 min,95 °C 15 s,60 °C 30 s,72 °C 30 s,循環(huán)45 次。結(jié)束后以2-△△CT值計算EphB3 相對表達水平。EphB3 及U6 引物序列按相關(guān)文獻獲得[7-8],U6 上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',U6 下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3';EphB3上游引物：5'-GGC CATAGCCTATCGGAAGT-3',EphB3 下游引物：5'-TCCCAGTAGGGTCGCTCTC-3'。所用引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 病理參數(shù) 患者病理參數(shù)包括年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、TNM 分期、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Ki67、人表皮生長因子受體-2（HER-2）表達、分子分型和病理類型。乳腺癌組織學(xué)分級分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級[9],按第八版乳腺癌AJCC分期體系作為TNM 分期依據(jù)[10]。Ki67 表達＞20%為陽性[11];三陰性乳腺癌定義為ER、PR 和HER-2 均陰性的乳腺癌;HER-2 陽性定義為免疫組織化學(xué)結(jié)果為3+或ISH 檢測陽性。原位癌包括導(dǎo)管內(nèi)癌和小葉原位癌。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 26.0 和GraphPad-Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析和圖片繪制。計量資料以±s表示,組間比較采用t 檢驗和方差分析;計數(shù)資料以頻數(shù)和率表示,組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EphB3受體在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達 EphB3 受體在乳腺癌組織中的表達水平高于對應(yīng)癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1。

圖1 EphB3 受體在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達

2.2 EphB3 受體表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 EphB3受體在乳腺癌中的表達與患者年齡、腫瘤直徑、TNM分期、ER、PR、HER-2、Ki67 表達及分子分型無相關(guān)性（P＞0.05）,與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級及病理類型有關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 EphB3 表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

2.3 EphB3 受體表達與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 患者術(shù)后出院通過電話和門診隨訪60 個月,復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移26 例,無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移54 例。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示,乳腺癌組織EphB3 高表達患者無進展生存期較低表達患者更短（P=0.019）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier 生存曲線

2.4 影響無進展生存期相關(guān)因素 采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型進行單因素和多因素分析,結(jié)果顯示,EphB3 受體高表達、HER-2 陽性、分子分型三陰性以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者無進展生存期的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌無進展生存期影響因素分析

3 討 論

乳腺癌為高度異質(zhì)性惡性腫瘤,個體化治療尤為重要[12]。Eph 受體家族通過受體與配體、適配器蛋白和觸發(fā)下游信號通路的相互作用產(chǎn)生影響,不公影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而且為新的癌癥靶向策略提供基礎(chǔ)[13]。在非小細(xì)胞肺癌中EphB3 受體以一種不依靠激酶的通路促進腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和種植,可能成為治療非小細(xì)胞肺癌的有效治療靶點。

本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組織EphB3 受體表達水平顯著高于對應(yīng)癌旁正常組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）,提示EphB3 受體在乳腺癌中發(fā)揮促瘤作用,有望成為乳腺癌新的治療靶點。文獻報道,EphB3 受體在結(jié)直腸癌和卵巢漿液性癌中的表達顯著降低,其過表達預(yù)示患者更好的預(yù)后[4-6],這與本研究結(jié)果矛盾,說明EphB3 受體在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用依賴于腫瘤類型。

EphB3 受體與多種人類癌癥的進展和預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,EphB3 受體表達與乳腺癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型密切相關(guān),組織學(xué)分級越高、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理類型為浸潤性癌的患者EphB3 受體表達越高。EphB3 受體高表達患者無進展生存期顯著縮短,Cox 比例風(fēng)險回歸模型表明EphB3 受體高表達、HER-2 陽性、分子分型三陰性以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌不良預(yù)后的獨立危險因子。與預(yù)期相反的是,本研究中不同TNM 分期和分子分型乳腺癌中EphB3 受體表達無顯著差異,這可能與樣本量小有關(guān)。

綜上所述,EphB3 受體在乳腺癌組織中表達水平明顯增高,EphB3 受體高表達是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素。本文為回顧性研究,患者臨床分期較好,大部分為浸潤性癌,少部分為原位癌,不同手術(shù)方法和術(shù)后輔助治療可能影響患者預(yù)后,需要進一步研究。今后應(yīng)增大樣本量,開展細(xì)胞實驗,分析EphB3 受體對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖的作用,進一步探索EphB3 受體促進乳腺癌進展的分子機制。