基于偏最小二乘法分析枇杷葉提取物中α-葡萄糖苷酶抑制劑

孔紅銘 趙楠星 夏旭東 袁 芳 曹少謙 戚向陽 陳秋平

（浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一類與胰島素分泌缺陷相關，以高血糖為特征的代謝性疾病［1］。常見癥狀有多食、多飲、多尿以及消瘦等［2］，久病可致眼、腎、心臟等器官出現慢性損害［3］。目前口服降糖藥和注射胰島素通常可以控制糖尿病。天然α-葡萄糖苷酶抑制劑因副作用小，能夠有效控制糖尿病患者餐后血糖上升等優勢而成為輔助治療Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的首選藥物。市面上常見的α-葡萄糖苷酶抑制劑大多為人工合成且副作用較多，例如阿卡波糖會引起腹脹、腹瀉、腹痛等不良反應［4］。

獨特的傳統醫學理論讓中醫藥在糖尿病及其并發癥的治療方面有著良好的效果和廣闊的前景。陳海君等［5］運用親和超濾技術從毛菊苣種子提取物中篩選并鑒定出4 種α-葡萄糖苷酶抑制劑；Chen 等［6］通過沉淀交聯法將豬胰脂肪酶固定在金屬有機骨架上，篩選出夏枯草中的脂肪酶抑制劑，獲得13 種可抑制脂肪酶的小分子化合物。枇杷葉（Eriobotrya japonica）為薔薇科植物枇杷的干燥葉［7］，作為傳統中藥，其性微寒、味微苦，有清肺止咳、降逆止嘔之功效［8］，主要化學成分為三萜酸類、黃酮類、多酚類等物質［9］。近年來，枇杷葉在抗炎、抗氧化［10］、降血糖［11］等方面的作用逐漸受到關注，枇杷葉所含化合物十分復雜，目前尚缺乏對枇杷葉抗糖尿病的藥效成分及作用機制的整體認識。

本試驗采用偏最小二乘回歸分析法，對枇杷葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性組分的超高效液相色譜-質譜聯用（ultra-high performance liquid chromatographymass spectrometry，UPLC-MS）特征圖譜與體外酶抑制藥效進行相關性分析，以篩選出枇杷葉提取物中抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分，初步揭示其物質基礎。旨在從天然產物中尋找藥效溫和、毒副作用小的α-葡萄糖苷酶抑制劑，以解決糖尿病人的實際需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-葡萄糖苷酶（50～120 kDa），西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；阿卡波糖、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（分析純）、科羅索酸、奎寧酸，國藥集團化學試劑有限公司；枇杷葉（產地品種見表1）；甲酸、乙腈（色譜純），德國Merk公司；試驗用水為重蒸水。

表1 枇杷葉樣品信息Table 1 Loquat leaf sample information

1.2 儀器與設備

DXF-04D 手提式磨粉機，廣東大祥儀器有限公司；RE2000 旋轉蒸發器，上海亞榮儀器有限公司；Centrifuge 5804R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；U570超低溫冰箱，英國NBS公司；FD-1F-80T真空冷凍干燥機，上海舜制儀器有限公司；TU-1810可控溫紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；Waters Synapt G2 MS 超高效液相色譜-質譜聯用儀，美國Waters公司。

1.3 試驗方法

1.3.2 提取物對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用 空白酶活的測定：用0.1 mmol·L-1磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline ，PBS，pH 值6.8）將α-葡萄糖苷酶配制成1.5 U·mL-1的溶液，用于酶活性分析［12-13］。比色皿中加入1.8 mL PBS 緩沖液，于37 ℃預熱5 min，待其溫度穩定后，加入100 μL PNPG（5 mmol·L-1）溶液，然后加入20 μL 1.5 U·mL-1酶液，迅速搖勻，于405 nm 處檢測其2 min 內吸光度值的變化，平行測定3次，計算酶活性（enzymatic activity，EA）［14-15］。

樣品和陽性對照阿卡波糖的半抑制濃度（semiinhibition concentration，IC50）測定：緩沖液預熱后，加入100 μL PNPG，再加入不同體積梯度的抑制劑，其余步驟同上，抑制率計算公式如下：

將抑制劑濃度及其對應的抑制率輸入CalcuSyn Demo軟件，計算半抑制濃度，并通過SPSS 25軟件進行抑制率曲線繪制。

1.3.3 LE 對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的動力學分析 以IC50值最低的LE 為樣品組，控制反應時間、溫度、pH 值等不變，在添加相同濃度不同體積（0、30、60、75 μL）抑制劑的條件下，改變底物PNPG 的添加量（90、32、20、13、10 μL），測定α-葡萄糖苷酶酶促反應速率（V），以底物濃度倒數（1/［S］）為橫坐標，反應速率倒數（1/V）為縱坐標，采用Lineweaver-Burk 雙倒數作圖分析［16］，再以抑制劑濃度為橫坐標，雙倒數圖中不同直線的斜率（Vmax/Km）為縱坐標，得到與x軸相交的直線，并求出Ki，確定抑制類型［17-18］。Vmax和米氏常數Km計算公式如下：

式中，Vmax為最大反應速率（μmol·L-1·s）；［S］為底物濃度（μmol·L-1）；Km為米氏常數（μmol·L-1）。

1.3.4 UPLC-MS 特征圖譜建立 色譜條件：運用Synapt G2 MS 超高效液相色譜-質譜聯用儀，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動相A 為2 mmol·L-1乙酸銨+0.2%甲酸溶液，流動相B 為乙腈。洗脫梯度：0～1 min，20% B；1～9 min，20%～45% B；9～21 min，45%～98% B。進樣量2 μL，流速0.2 mL·min-1，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃。

質譜條件：采用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），負離子模式采集，自動增益控制（automatic gain control，AGC）目標值5 e5；噴霧電壓為3 500 V，離子傳輸管溫度為350 ℃，鞘氣壓40 arb，輔助氣壓10 arb。

1.3.5 譜效關系分析 以特征圖譜中代表化合物的各色譜峰的峰面積為自變量（X），LE 對α-葡萄糖苷酶的抑制率為因變量（Y）［19-20］，導入SIMCA 14.0軟件，采用偏最小二乘回歸分析（partial least square，PLS）進行回歸分析。

第四，分銷渠道延伸性較弱，忽視促銷策略。直接渠道模式，是南通鵬越紡織有限公司的主要分銷模式，但這在一定程度上制約了企業的發展，且對競爭對手的了解相對落后。且在促銷實踐中，推銷人員不足，推銷力度廣度都不夠，新客戶群體的獲得都會受到不同程度的影響。

1.3.6 分子對接 從中藥系統藥理學數據庫（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）下載配體化合物結構，采用Chem3D 軟件將其進行能量最小化處理［21］。在蛋白質數據庫（protein data bank，PDB，https：//www.rcsb.org/）檢索α-葡萄糖苷酶（PDB ID：3A4A），保存為pdb格式，通過Pymol 2.5.0對蛋白結構刪除水分子、去除修飾配體［22］，再使用AutoDock Tools 1.5.6將活性成分和α-葡萄糖苷酶轉換為pdbqt格式，并通過AutoDock Vina 1.1.2 進行分子對接。通過LigPlus 2.5.5分析配體與蛋白的氫鍵、疏水作用力等。

1.4 數據處理

使用SPSS 25.0 軟件進行數據統計，繪制抑制率曲線；通過CalcuSyn Demo 軟件計算提取物對α-葡萄糖苷酶的IC50值。

2 結果與分析

2.1 枇杷葉提取物的抑制作用

由圖1可知，不同品種產地的LE對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，并表現出一定的濃度依賴性［23］，IC50為1.31～2.65 μg·mL-1，遠低于陽性對照阿卡波糖（樣品K，IC50值為81.98 μg·mL-1），其中抑制效果最佳品種為陜西漢中野生（IC50值為1.31 μg·mL-1）。

圖1 種植品種的枇杷葉提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率曲線Fig.1 Inhibition rate curve of α-glucosidase by different varieties of LE

2.2 LE對α-葡萄糖苷酶的的抑制類型

陜西漢中野生品種對α-葡萄糖苷酶的動力學結果如圖2所示，Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法顯示直線相交于第Ⅰ象限，非常接近Y 軸，表明提取物對α-葡萄糖苷酶表現為競爭型抑制［24］，即提取物中的活性成分與酶促反應底物競爭α-葡萄糖苷酶的活性位點。通過二次作圖計算得到其抑制常數Ki為0.491 mmol·L-1。

圖2 LE對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig 2 Lineweaver-Burk curves for the inhibition of α-glucosidase by LE

2.3 UPLC-MS特征圖譜

10 批LE 的 UPLC-MS 特征圖譜如圖3所示，通過Integrate chromatogram 軟件自動積分，分別導出特征圖譜中的各峰面積，根據各樣品特征圖譜的各峰保留時間，共匹配出16 個共有峰，如表2所示，其中X1、X5 和X6 峰面積相對較大，意味著所對應化合物在LE 中占比相對較大，而X2、X4、X11、X13 等峰面積雖相對較小，但不同品種產地LE 的峰面積大小并非直接與α-葡萄糖苷酶抑制率呈正相關，因此，需要通過偏最小二乘法進一步分析。

圖3 10批LE的UPLC-MS特征圖譜Fig.3 UPLC-MS characterization of 10 batches of LE

表2 不同品種LE活性組分共有峰峰面積Table 2 The common peak areas of active components from different varieties of LE/（mAU·min）

2.4 譜效關系分析

2.4.1 偏最小二乘回歸方程 以圖3 中16 個共有色譜峰的峰面積為自變量（X），LE 對α-葡萄糖苷酶的抑制率為因變量（Y），采用PLS模型進行偏最小二乘回歸分析，數據選擇標準差標準化處理，消除變量量綱差異，得到如下回歸方程：Y=0.096X1-0.021X2-0.011X3+0.321X4+0.125X5-0.122X6-0.118X7-0.168X8-0.175X9-0.172X10+0.117X11-0.050X12+0.286X13-0.183X14-0.061X15+0.246X16，PLS模型抑制系數見圖4。

圖4 LE抑制α-葡萄糖苷酶譜效關系偏最小二乘回歸系數Fig.4 Partial least square regression coefficient of the spectral-effect relationship of LE inhibiting α-glucosidase

2.4.2 變量重要性分析 PLS 回歸模型采用回歸系數和變量重要性綜合評價各特征共有峰對α-葡萄糖苷酶抑制活性的貢獻大小，在回歸方程中，系數為正值的自變量與抑制率呈正相關，反之則呈負相關。各特征峰的回歸系數表明，X1、X4、X5、X11、X13、X16 與酶抑制活性呈正相關，變量重要性投影值（variable importance in project，VIP）顯示X4、X13、X16的值較大，變量重要性均大于1.0。在PLS 分析中，VIP 反應自變量X對因變量Y的解釋能力大小，VIP值越大，自變量X的解釋能力越強［25］。因此，綜合評價各特征峰的貢獻小大排序為 X4＞X13＞X16＞X11＞X5＞X1，表明峰 4、13、16、11、5、1 在UPLC-MS 特征圖譜上代表的化合物為LE 抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性物質。

圖5 各共有峰對LE抑制酶活性的變量重要性分析Fig.5 Variable importance analysis of common peaks on inhibitory enzyme activity of LE

通過UPLC-MS 獲得峰 4、13、16、11、5、1的二級質譜碎片信息并匯總至表3，結合TCMSP、PubChem 數據庫和相關文獻數據［26-27］，對上述6 個化合物進行鑒定分析，其中，峰1、峰13 用標準品進行二級質譜碎片信息比對，確定成分分別為奎寧酸和科羅索酸。

表3 化合物成分鑒定結果Table 3 Identification results of compound components

2.5 分子對接驗證

由表4可知，活性成分在氫鍵和疏水作用力的共同作用下與α-葡萄糖苷酶相互作用，其中科羅索酸、科羅索酸甲酯與α-葡萄糖苷酶結合能小于-8.0 kcal·mol-1，NRRRG、奎寧酸的結合能小于-6.0 kcal·mol-1，奎寧酸的結合能相對最高，說明科羅索酸、科羅索酸甲酯對α-葡萄糖苷酶的抑制效果優于NRRRG和奎寧酸。

表4 枇杷葉關鍵成分與α-葡萄糖苷酶對接結果Table 4 Docking results of key components of loquat leaf with α-glucosidase

運用LigPlus2.5.5 進行配體與蛋白之間相互作用力分析，結果如圖6所示。以科羅索酸為例，能夠順利與α-葡萄糖苷酶蛋白活性口袋結合，通過與活性口袋的 Asp307、Gly309、Thr310、Thr310、Ser304 氨基酸形成分子間氫鍵來維持配體與蛋白活性口袋的穩定，4 種活性成分中科羅索酸的氫鍵數量最多，與表4 結果一致。

圖6 活性成分與α-葡萄糖苷酶的分子對接結果Fig.6 Molecular docking results of active components with α-glucosidase

3 討論

本研究發現，不同品種產地的LE 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在較大差異，IC50最大值與最小值相差一倍，究其原因，可能是提取物成分復雜，多種化合物共同競爭α-葡萄糖苷酶的活性中心，由此產生協同作用，使抑制效果增強［28］，本研究結果為譜效關系研究提供了良好的數據基礎。枇杷樹適宜在氣候濕潤的地區生長，在生長過程中對溫度要求較高，年平均溫度應在12～15 ℃范圍內，冬季氣溫不低于-5 ℃［29］。通過分析10 批枇杷葉的品種產地發現，人工種植的解放鐘（廣東省韻關市）和早鐘6 號（福建省漳州市）對α-葡萄糖苷酶的IC50值較低，酶抑制效果較好，這兩個品種均生長于年平均降水量1 600 mm 以上的東南沿海地區［30］，同屬亞熱帶季風氣候，夏季受海陸氣溫差異影響，來自太平洋的氣流攜帶大量水汽不斷吹向大陸［31］；而大五星（四川省綿陽市）、白沙（浙江省溫州市）和白玉（江蘇省蘇州市）枇杷葉的產地年平均降水量為800 mm，雖處于氣候濕潤區，但無法保證充沛的水量用于開花結果［32］，因此，這三地所產枇杷果實相對前兩地體積稍小，葉中活性成分的積累也相對較少。

LE可以有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，但主要活性成分未知。采用傳統的分離方法鑒定活性單體不僅效率低，且容易丟失活性目標。偏最小二乘回歸法是集多功能為一體的多元數據分析方法，是構建中藥譜效關系的一個重要工具［33］。肖作兵等［34］通過氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GCMS）結合偏最小二乘法，以甜橙油為研究對象，成功鑒定出15種風味化合物；孫飛等［35］通過偏最小二乘法分析山楂和焦山楂化學成分與消食健脾功效的相關性，共計識別出11 種功效成分。通過前期的酶抑制試驗發現，枇杷葉提取物的IC50值低于阿卡波糖，但尚未明確具體是哪些化合物發揮主要的酶抑制作用，因此，本研究采用偏最小二乘法分析枇杷葉提取物與α-葡萄糖苷酶抑制率之間的譜效關系，對活性成分進行快速定位。通過PLS 分析發現，枇杷葉中各共有成分對α-葡萄糖苷酶抑制率均有影響，在16 個共有活性成分中，6 個活性成分對抑制率影響較大，說明LE 的酶抑制能力是多種活性成分共同作用的結果，符合天然活性成分“多通路、多靶點”的特點。同時，6 個活性成分回歸系數較大，說明其對抑制率貢獻較高［36］。卞振華等［25］、黃廣偉等［37］認為，VIP值是反映自變量對因變量解釋能力的重要指標，其值越大說明該自變量對因變量的解釋能力越強。因此，本研究認為峰1、4、5、11、13、16 在UPLC-MS 特征圖譜上代表的化合物為LE 抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性物質。

通過分析化合物二級質譜碎片信息，結合文獻數據庫進行比對，鑒定得到4 個化合物。由于α-葡萄糖苷酶是臨床上用于降血糖的關鍵靶點［38］，因此將篩選得到的活性成分與α-葡萄糖苷酶進行計算機輔助分子對接模擬，通過分子對接模擬，發現科羅索酸的結合能最低，同時氫鍵數量最多，主要集中在6號碳原子與14號碳原子上的羥基，推測科羅索酸在與α-葡萄糖苷酶結合時，通過疏水作用力與氫鍵共同起作用，其中氫鍵在結合過程中起主導地位，與α-葡萄糖苷酶的Asp307、Gly309、Thr310、Thr310、Ser304 號氨基酸殘基存在氫鍵相互作用。此外，4 個活性成分與α-葡萄糖苷酶的結合能均小于-6.0 kcal·mol-1，是十分良好的天然α-葡萄糖苷酶抑制劑［39］。通過與對照品比對，最終確定峰1、峰13分別為奎寧酸和科羅索酸，然而尚有部分化合物未能成功鑒定。由于NRRRG 和科羅索酸甲酯目前在國內無法購買，未能鑒定峰4、峰16具體為何種化合物，將在后續深入研究中，通過色譜分離等相關技術獲得較高濃度的富集物，進一步鑒定化合物成分。

4 結論

本試驗通過UPLC-MS 特征圖譜結合偏最小二乘回歸法分析α-葡萄糖苷酶的活性抑制組分與UPLCMS特征圖譜共有峰并進行關聯研究，揭示了枇杷葉提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性物質的基礎，確定峰1、峰13為奎寧酸、科羅索酸，分子對接結果表明，α-葡萄糖苷酶與科羅索酸、科羅索酸甲酯、nerolido-3-α-Lrhamnopyranosyl（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl（1→6）］-β-D-glucopyranoside、奎寧酸的結合活性較強。本試驗結果為闡明枇杷葉提取物降糖機理提供了一定的理論依據。