中江白芍加工前后不同部位的重金屬分析與風險評估
2023-05-07 13:32:56王曉曉
西北藥學雜志 2023年3期
李 曦,馬 越,王曉曉
1.四川省藥品檢驗研究院(四川省醫療器械檢測中心),成都 611730;2.四川科倫藥物研究院有限公司,成都 611138;3.綿陽市食品藥品檢驗所,綿陽 621000
白芍為毛茛科芍藥PaeonialactiforcPall.的干燥根的加工品。作為大宗藥材,白芍在經典名方四物湯、逍遙散和芍藥甘草湯中均有應用,2020年版《中國藥典》(簡稱藥典)中含有白芍的中成藥達189種,如四物顆粒、根痛平顆粒和麻仁丸等。德陽市中江縣作為白芍的道地產區之一,種植歷史悠久,面積廣泛。芍藥在種植過程中隨著化肥和農藥的使用會引入重金屬,植物從污染環境中吸取養分的同時,也會對重金屬進行富集,造成中藥中重金屬含量超標,從而影響藥材的安全性。藥典中僅對白芍進行了重金屬限量的規定[1]。重金屬元素不是人體必需元素,通常對人體有害,服用被污染的中藥材會使重金屬進入體內不能被肝臟分解代謝而積存在大腦、腎臟等人體重要器官,超出人體的調節限度就會對人體正常代謝產生明顯毒性,損傷人體正常機能,導致健康問題[2-4]。對中江白芍中重金屬的分析和健康風險評估可從源頭明確中江白芍的安全性情況,并指導中江白芍的綜合利用和產業的可持續發展。本研究以四川中江種植芍藥根(SY)及其須根(XG)與經加工后的白芍(BS)和栓皮(SP)等不同部位及根際土壤(TR)作為研究對象,測定以鉛(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、銅(Cu)和鎘(Cd)為代表的重金屬元素,研究白芍加工前后不同部位的安全性并進行重金屬健康風險評估,為白芍的安全性質量控制以及臨床安全用藥奠定基礎。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Agilent 7900電感耦合等離子體質譜儀(美國Agilent公司);百萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);KQ-700DV超聲清洗儀(昆山市儀器超聲有限公司);MARS 6微波消解儀(美國CEM公司);EHD-24電熱消解儀(北京東航科技儀器有限公司)。
1.2 試藥
100 μg·mL-1多元素對照品溶液(Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、Hg、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Ti、V、Zn)來源于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。Bi、Ge、In、Li、Sc和Tb的混合內標溶液(Agilent公司,10 μg·mL-1),氫氟酸、磷酸、高氯酸為分析純、硝酸為離子級(成都市科隆化學品有限公司);超純水(ULPHW-111-10T型,四川優普超純科技有限公司)。35份芍藥樣品及根際土壤均從四川中江縣采集,見表1,經德陽市食品藥品安全檢驗檢測中心李茂森主任中藥師鑒定為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的根。35份新鮮芍藥根采收后,除去芽頭,置于清水中除去泥沙,晾干后,放入烘箱中,60 ℃烘干,即得白芍加工前的樣品芍藥根(編號1～37對應樣品SY1～SY37,共35份)。收集芍藥根剪下的細根,干燥后即得加工前的須根(編號1～37對應須根XG1～XG37,共32份樣品,無XG4、XG11、XG19、XG25、XG26)。收集須根周圍的泥土即得根際土壤樣品(編號1～37對應土壤編號TR1～TR37,無TR19、TR20)35份。新鮮芍藥根先用沸水煮透心,竹刀刮去外皮,55 ℃烘干,即得加工后的白芍樣品(編號1～37對應白芍編號BS1～BS37,共35份樣品,無BS19、BS20)[5]。另外,收集白芍加工過程中刮下的栓皮,置于烘箱中55 ℃烘干,得到加工后栓皮樣品(編號1～37對應栓皮SP1～SP37,共35份樣品,無SP19、SP20)。不同部位樣品及土壤見圖1。
表1 芍藥樣品來源
注:A. 白芍;B. 芍藥;C.栓皮;D. 須根;E. 土壤。
2 方法
2.1 重金屬對照品溶液的制備
用多元素混合標準母液以體積分數為5%的優級純HNO3為介質配制成含Pb、Cd、As、Cu均為0、20、50、100、200、500 ng·mL-16個質量濃度梯度的混合對照品溶液,同時制備空白溶液。Hg以體積分數為5%的優級純HNO3為介質配制成質量濃度分別為0、0.5、2、5、10、20 ng·mL-1的Hg對照品溶液,同時制備空白溶液。溶液均過0.45 μm的微孔濾膜。
2.2 內標溶液的制備
精密量取混合內標液適量,用水稀釋制成200 ng·mL-1的混合對照品溶液,即得。
2.3 ICP-MS的測定條件
等離子射頻功率1 550 W,等離子氣體流量15 L·min-1,輔助氣體流量1.03 L·min-1,霧化氣流量1.03 L·min-1,補償/稀釋氣體1 L·min-1,霧化室溫度2 ℃,蠕動泵速度0.1 rps。采樣深度8.0 mm,積分時間1 s,延遲時間1 s,重復次數3次;測量方式為標準曲線法;讀數方式為峰強。以73Ge、115In、209Bi為內標,能有效克服儀器信號的漂移和校正基體效應。
2.4 供試品溶液的制備
2.4.1植物樣品的重金屬元素供試品溶液的制備 白芍取樣品粉末0.2 g(過5號篩),精密稱定,于聚四氟乙烯消解罐中,置于通風櫥,加入濃硝酸8 mL,放置過夜。第2天放入微波消解儀中,按設定的消解程序處理:先經10 min由室溫升至130 ℃,并維持5 min消解,然后10 min由130 ℃升至165 ℃,并維持10 min消解,然后15 min由165 ℃升至180 ℃,并維持40 min消解。消解完畢后,冷卻至室溫,取出消解罐,在通風櫥中將消解罐中液體揮發至2～3 mL,轉移,用去離子水定容至50 mL。同步以硝酸8 mL做空白實驗。
2.4.2土壤樣品重金屬元素供試品溶液的制備 精密稱取土壤樣品0.10 g(過6號篩),置于聚四氟乙烯消解罐內,精密加入HNO3和HClO4體積比1∶1混合酸液5 mL,再精密加入HF 5 mL。放置過夜,按照2.4.1項下方法消解。不加土壤樣品作試劑空白對照。將消解好的樣品用超純水沖洗轉移至50 mL量瓶內定容。經0.45 μm微孔濾膜濾過后上機測定。
2.4.3標準曲線的制備 取多元素的混合對照品母液,依次測定各元素的系列質量濃度對照溶液,內標進樣管始終插入內標溶液。以對照品質量濃度為橫坐標(x)、重金屬元素分析峰信號值與內標元素參比峰響應值的比值為縱坐標(y),繪制標準曲線,得各重金屬元素對照品的回歸方程、相關系數和線性范圍。結果Pb、Cd、As、Cu元素在20～500 ng·mL-1范圍內線性良好。Hg在0.5～20 ng·mL-1范圍內線性關系良好,見表2。
表2 重金屬元素標準曲線
2.5 方法學考察
精密度實驗。取混合對照品溶液分別連續進樣6次測定各元素含量,各元素的RSD值為0.76%～2.09%,表明儀器的精密性良好。
穩定性實驗。分別取同一份白芍樣品的待測溶液,分別于0、4、8、12、16、20、24 h測定各元素的含量。RSD值為0.78%～2.11%,表明待測溶液在24 h內穩定。
重復性實驗。分別精密稱取同一份白芍和土壤樣品各6份,制成供試品溶液,測定各元素的含量,其RSD值為1.38%～4.01%,說明方法的重復性良好。
加樣回收率實驗。分別精密稱取已測定的白芍樣品0.1 g,6份,精密加入一定量的各元素的對照品溶液,測定其含量,計算各重金屬元素的回收率,回收率為92.80%～106.40%,RSD值為1.98%～3.29%,說明方法的準確性高。
2.6 樣品的重金屬元素測定
按照2.4.1項下方法制備白芍、芍藥根、須根、栓皮和土壤的供試品溶液。在設定的實驗條件下,測定所有樣品中重金屬元素的含量。用SPSS 22進行統計分析。
2.7 安全性評估的計算
(1)靶標危害系數(target hazard quotients, THQ)是美國國家環境保護局提出的一種用于評估人體通過食物攝取重金屬產生非致癌風險的方法[6],計算每份樣品的重金屬THQ。
其中,C為污染物中重金屬質量分數(mg·kg-1);EF為每年暴露于毒物(此處指白芍、栓皮、芍藥根和須根中重金屬)的時間(天數,每年EF設定為30 d);ED為暴露于毒物(此處指含重金屬中藥材)的時間(年數,30年);FIR為每日攝取含污染物的食物量(成人按平均每天服用5 g計,兒童按2 g計);WAB為人體平均體質量(采用國際通用標準,成人為55.9 kg,兒童為32.7 kg);AT為平均接觸非致癌毒物(此處指含重金屬中藥材)的時間,為平均人壽命70年×365。RfD為口服參考劑量,本應由USEPA提供,但由于USEPA僅給出了無機砷的RfD,因此參考ISO 18664和藥典中殘留重金屬的限量指導原則規定,此處在計算時,選用了由WHO提供的暫定每周耐受攝入量(provisional tolerable daily intake, PTWI)[7-12]:Cu為0.28 μg·g-1,Pb為25 ng·g-1,As為15 ng·g-1,Cd為7 ng·g-1,Hg為5 ng·g-1。
(2)綜合危害指數(hazard index, HI)由于中藥中同時存在多種重金屬,故用綜合危害指數評估其非致癌風險,公式為HI=THQPb+THQCd+THQHg+THQAs。其中,HI是非致癌風險綜合危險指數,THQPb是Pb的靶標危害系數,THQCd是Cd的靶標危害系數,THQHg是Hg的靶標危害系數,THQAs是As的靶標危害系數。
3 結果與分析
3.1 白芍加工前后不同部位重金屬元素的比較
藥典中僅規定白芍重金屬的限量標準Pb≤5.0 mg·kg-1,Cd≤1.0 mg·kg-1,Hg≤0.2 mg·kg-1,As≤2.0 mg·kg-1,Cu≤20.0 mg·kg-1。參考該標準,35份白芍和芍藥根均合格。須根和栓皮重金屬均高于芍藥根和白芍,特別是Pb,須根平均含量高達20.43 mg·kg-1,栓皮平均含量高達24.95 mg·kg-1,結果見表3至表5,說明Pb在須根和栓皮部的含量遠高于白芍和芍藥根。須根和栓皮雖然作為非藥用部位,未見重金屬的限量規定,但因白芍的主要有效成分在皮部含量較高[13-14],會考慮將其作為白芍新的藥用資源開發或以中成藥的原料投產。因此,明確其重金屬的含量一方面佐證白芍的產地加工對安全性具有重要指導意義,另一方面不建議將栓皮和須根開發為新的藥用資源。
表3(續) 白芍與栓皮重金屬的綜合得分Z值及含量
表4 芍藥根與須根重金屬的綜合得分Z值及含量
表4(續) 芍藥根與須根重金屬的綜合得分Z值及含量
3.2 土壤中重金屬元素的分析
土壤樣品遵循《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準(試行)》(GB15618-2018)中的土壤污染風險篩選。Cu、Pb、Cd、Hg均處于土壤污染風險篩選值以下,As有3份土壤(TR24、TR25、TR29分別為58.857、53.833、56.216 mg·kg-1)均超出了風險篩選限量值≤40 mg·kg-1,但均在污染風險管制值以內,結果見表5。測定的35份土壤的重金屬含量總體處于風險篩選值以下,說明土壤重金屬污染風險低。
表5 芍藥根際土壤重金屬的含量
3.3 白芍加工前后不同部位對重金屬的富集特性
富集系數(BCF)表示植物體從土壤環境富集某元素能力強弱的趨勢,在一定程度上反映了沉積物或土壤中無機元素向植物體內遷移的難易程度,表現了無機元素在植物體內的富集情況[10]。其計算公式為BCF=C植物體/C土壤,式中C植物體為植物體內某一部位(BS、SY、XG、SP)的無機元素含量(mg·kg-1),C土壤為土壤中對應的無機元素含量(mg·kg-1)。當重金屬數BCF<0.1時表示強烈貧化,BCF<0.5時相對貧化,0.5
表6 白芍加工前后不同部位重金屬BCF及平均含量
3.4 白芍加工前后不同部位重金屬的主成分分析
將白芍、芍藥根、栓皮和須根樣品的重金屬元素含量的結果輸入SPSS 22統計軟件,設置提取因子數量為5,進行主成分分析,得到總方差的解釋和成分矩陣,5個主成分的初始特征值分別為2.81、0.85、0.55、0.48、0.31,累積百分比為100%,計算得到Z1、Z2、Z3、Z4、Z5的5個主成分,表達式分別為:
Z1=0.827Cu+0.767As+0.742Cd+0.853Pb+0.505Hg,
Z2=-0.197Cu+0.114As-0.25Cd-0.189Pb+0.836Hg,
Z3=-0.065Cu-0.47As+0.533Cd-0.087Pb+0.188 4Hg,
Z4=-0.395Cu+0.413As+0.39Cd-0.209Pb-0.1Hg,
Z5=0.345Cu+0.074As+0.043Cd-0.431Pb-0.014Hg。
把各主成分相加,得到總的重金屬表達式Z=0.517Cu+0.897As+1.386Cd-0.063Pb+1.415Hg,把重金屬元素的含量代入Z,得到每份樣品的綜合得分值,結果見表3至表5。芍藥根與須根相比,芍藥根的綜合得分值為2.8～7.2,平均值為4.7(n=35);須根的綜合得分值為4.0～16.4,平均值為6.4(n=32)。加工后白芍與栓皮比較,白芍的綜合得分值為2.3～5.6,平均值為3.3(n=35);栓皮的綜合得分值為5.1～14.5,平均值為8.9(n=35)。白芍與芍藥相比,綜合得分更低。以重金屬元素主成分分析的綜合得分為指標,綜合得分越高,安全性越低。安全性從高到低依次為白芍、芍藥根、須根、栓皮,說明水煮去皮等加工方式有利于降低藥材中的重金屬含量,使藥材的安全性更高。
3.5 白芍、栓皮、芍藥根和須根的安全性評估
根據《中草藥重金屬限量國際標準(ISO 186642015.8.1)》規定[17],THQ<1時,認為人體負荷的重金屬量對人體健康未造成明顯影響,否則認為人體所負荷的重金屬量已危害到人體健康。藥物THQ的計算應考慮每人每天攝入藥物所占食物的比例(成人1.5 kg,兒童0.8 kg)[18-19]。當THQ(或HI)<8×10-3,即可認為其所含重金屬量不會對成人健康有明顯影響;當THQ(或HI)>8×10-3,表明重金屬攝入水平高于安全限值,通過中藥攝入的重金屬對成年人人體有一定風險,應引起重視。THQ(或HI)<7.5×10-3,對兒童健康無明顯影響;THQ(或HI)>7.5×10-3,表明重金屬攝入水平高于安全限值,通過中藥攝入的重金屬對兒童有一定風險,應引起重視。
白芍的各重金屬的THQ和HI對成年人和兒童暴露人群健康均無明顯影響。芍藥根有1份樣品的THQPb對成人和兒童暴露人群健康均有明顯影響;HI中有14份樣品對成人暴露人群健康有影響,11份樣品對兒童暴露人群健康有影響。須根THQCd結果中有4份樣品對成人暴露人群有明顯影響,有1份樣品的Cd對兒童暴露人群有明顯影響,所有的THQPb和THQCu對成人和兒童暴露人群均有明顯影響。HI結果中所有須根對成人和兒童暴露人群均有明顯影響。栓皮安全性評估結果中,1份樣品的THQAs和4份樣品的THQCd對成人暴露人群有影響,1份樣品THQCd對兒童暴露人群健康有明顯影響,全部樣品的THQCu和THQPb對成人和兒童暴露人群的健康均有明顯影響。HI中,全部的栓皮對成人和兒童暴露人群均有明顯影響,結果見表7至表10。
表7 成人及兒童服用不同批次白芍時攝取重金屬的THQ和HI
表8 成人及兒童服用不同批次芍藥根時攝取重金屬的THQ和HI
表9 成人及兒童服用不同批次須根時攝取重金屬的THQ和HI
表10 成人及兒童服用不同批次栓皮時攝取重金屬的THQ和HI
對成人而言,須根的平均THQPb(43.3×10-3)、HI(52.5×10-3)均大于8×10-3,栓皮的平均THQPb(52.8×10-3)、THQCu(35.8×10-3)和HI(96.6×10-3)均大于8×10-3,說明須根和栓皮對暴露的成年人健康有明顯影響。對兒童,須根的THQPb(37×10-3)、HI(44.9×10-3)均大于7.5×10-3;栓皮的THQPb(45.1×10-3)、THQCu(30.6×10-3)和HI(82.6×10-3)均大于7.5×10-3,說明須根和栓皮對暴露的兒童健康有明顯影響。芍藥根與須根相比,重金屬的THQ及HI均較低;白芍與栓皮相比,重金屬的THQ及HI均較低,見表11、表12。說明白芍和芍藥根重金屬對人體健康影響更小、更安全,與主成分分析結果一致。
表11 成人服用白芍加工前后不同部位時攝取重金屬的THQ均值及HI
表12 兒童服用白芍加工前后不同部位時攝取重金屬的THQ均值及HI
4 討論
本項目用ICP-MS法測定白芍加工前的芍藥根(n=35)、須根(n=32)及其根際土壤樣品(n=35)與加工后的白芍(n=35)和栓皮(n=35)中重金屬元素Pb、Cd、Hg、As、Cu的含量。發現白芍和加工前的芍藥根重金屬均在安全限量范圍內,而須根與栓皮的Pb含量遠高于白芍和芍藥根。富集特性表明,須根與栓皮對Cd存在相對富集。重金屬的主成分分析和安全性評估表明,須根與栓皮中Pb存在安全風險。重金屬測定結果表明,白芍和加工前的芍藥根安全,可入藥使用;但須根和栓皮中Pb含量高并且對Cd相對富集,存在安全風險,不建議作為藥材替代白芍或作為原料藥使用。
芍藥的須根與栓皮對Cd存在相對富集。有研究表明,不少藥用植物對重金屬元素都有不同程度的富集作用,半夏對土壤的Cd具有明顯富集作用[20];根和根莖類藥材丹參、蔞蒿和姜黃等,莖葉類藥材艾納香、青蒿,花類藥材的菊花和紅花等的Cd含量超標率較高[21-24]。此外,中藥材中Pb含量超標率較高,有報道麥冬、甘草、續斷、半夏、姜黃等藥材的Pb超標[25],說明Cd和Pb在我國不同品種及藥用部位的中藥材中普遍存在。重金屬超標是目前中藥臨床安全用藥的關鍵問題。我國中藥材重金屬污染是一個長期而復雜的問題,與中藥材產地、品種、入藥部位、生長環境等諸多因素有著密切的關系。不同藥用植物入藥部位不同,重金屬污染水平也不同,究其原因除了與在生長過程中暴露在重金屬污染環境中的時間長短有關,還與其不同部位對重金屬元素的吸收富集能力有關。
中藥材中富集的重金屬通過口服等途徑進入人體內,使人慢性中毒。人體內Pb積累超過負荷值,會導致神經系統、造血系統、血管和消化系統等損傷[26-27];Cd在人體內積蓄可能會引起畸形、癌變,Cd及其部分化合物已被國際癌癥研究機構列為I類致癌物質[28]。在安全性評估中,無論是THQ,還是HI,表明白芍和芍藥根的重金屬含量均在安全范圍,對人體健康的影響程度低;而須根與栓皮中Pb和Cd具有潛在的健康風險。
為保證中藥材質量,應積極推行在生態環境良好的地區建立中藥材生產基地,首先加強藥材生產基地的土壤環境質量管理,加大產地土壤環境重金屬的監測力度,實施測土栽培,為全面規范化、標準化藥用植物栽培提供基礎條件;其次開展Pb等重金屬對藥用植物生長與品質影響的機制研究,明確土壤中Pb的形態分布以及Pb在藥用植物體內的富集與遷移規律,為藥用植物質量安全風險評估提供理論依據;三是強化藥材產地土壤重金屬Pb污染治理與修復技術研究,為全面提高藥材質量安全水平提供技術保障。避免中藥材在種植、采收、炮制加工、運輸、貯藏等過程中被污染。今后對中藥材重金屬的研究還應深入開展,一方面,建議進行Pb、Cd最小有毒劑量研究,并與Pb、Cd在體內代謝研究相結合,從而科學地探索Pb、Cd限量標準,為制訂統一的中藥材限量標準提供理論依據。另一方面,以水溶態為主的Cd能夠以被水溶洗的方式去除,因此,芍藥在加工成白芍經水洗和水煮的過程中Cd含量已降低。為更客觀地評價白芍的安全性,建議進一步研究Cd在芍藥根加工和炮制過程的轉移率及殘留量。
