響應(yīng)面法優(yōu)化婦科消糜栓的提取工藝

阿吉然姆·阿布拉,古麗米拉·卡德爾,吳 靜,阿布來提·阿布力孜*

1.阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院,阿克蘇 843000;2.新疆醫(yī)科大學藥學院,烏魯木齊 830011

我國對植物藥的應(yīng)用已有幾千年歷史,我國中草藥的使用從原始的煎煮到膏方、丸丹散劑、顆粒劑、片劑、栓劑、膠囊劑及注射劑等,新劑型不僅提高了藥物的使用范圍,并在一定程度上提高了藥物的療效[1]。消糜栓的處方組成包括黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊、赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠。其中君藥黃連是毛茛科多年生草本植物,最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并被列為上品,據(jù)《外科正宗》記載,黃連清熱燥濕、瀉火解毒,連翹清熱解毒、消腫散結(jié)。黃連含小檗堿(7%～9%)[2]、黃連堿、甲基黃連堿、掌葉防己堿、藥根堿等生物堿以及阿魏酸等酚性化合物和多種微量元素,具有抗微生物及抗原蟲、抗病毒、抗?jié)儭⒖寡譡3]、抑制血小板聚集和釋放等作用[4-5],對急、慢性炎癥反應(yīng)均有明顯對抗作用,且具有廣譜的抗菌活性。黃連與諸藥相比,有其獨特之處,它既能以苦燥濕,又能以寒除熱,一舉兩得。因此對黃連的開發(fā)利用,如研制新藥方面,具有廣闊的國際市場前景。石榴皮所含的化學成分多,對人體有預(yù)防和保健作用,其提取物具有明顯抗菌活性,甲硝唑耐藥株及敏感株均對其敏感[6-7]。菝葜則能消腫解毒、祛風利濕,有抗炎鎮(zhèn)痛及抗腫瘤作用[8-9]。野苜宿中的苜宿素主要通過抑制炎癥介質(zhì)釋放,發(fā)揮抗炎作用[10-11]。《本草綱目》中記載乳香的藥理作用有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化、抗哮喘,在臨床上主要用于治療風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎,且炮制后的乳香抗炎活性更為顯著[12-13]。其他入藥成分洋甘菊、赤石脂、洋乳香也具有抗菌、抗炎活性[14-16]。

消糜栓的抑菌、殺菌作用強,能提高細胞吞噬致病菌能力,對假絲酵母菌、滴蟲及革蘭氏陰性菌、大腸桿菌、綠膿桿菌有極強的抑制活性和殺滅作用[17-18],并具有抑制炎性介質(zhì)分泌、凝固相關(guān)蛋白,發(fā)揮收斂作用、促進創(chuàng)面愈合、減少白帶增多等功效。消糜栓可通過保護生理菌群的生長,迅速減輕外陰瘙癢,其含有的營養(yǎng)物質(zhì)可為黏膜細胞提供營養(yǎng),改善微循環(huán),促進黏膜鱗狀細胞的再生,加速創(chuàng)面愈合,增強免疫能力,使病變部位加速恢復(fù)到正常的生理功能。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUW120型分析天平(上海梅特勒托利多有限公司); 2489紫外可見光檢測器-e2695高效液相色譜儀(美國Waters有限公司);KDM型電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);HHS-6S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海光地儀器設(shè)備有限公司);TFCW-12B型超微粉碎機(天方機械有限公司);Cascada PT型超純水制備系統(tǒng)(美國PALL公司)。

1.2 試藥

沒食子酸對照品(批號YA0505YA14,上海源葉生物科技有限公司);甲醇、乙腈為色譜純;乙酸乙酯、甲苯、石油醚(沸程為60 ℃～90 ℃,30 ℃～60 ℃)均為分析純;水為實驗室自制超純水。

黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊、赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠均由新疆阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院提供,經(jīng)阿克蘇地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥劑科主任吳靜副主任中藥師鑒定為正品藥材。

2 實驗方法

2.1 處方介紹

消糜栓的處方組成:黃連15 g,菝葜15 g,石榴皮15 g,野苜蓿15 g,洋甘菊15 g,赤石脂10 g,洋乳香10 g,乳香10 g,西黃耆膠5 g。黃連、菝葜、石榴皮、野苜蓿、洋甘菊用蒸餾水提取后與赤石脂、洋乳香、乳香、西黃耆膠配成處方藥制備成栓劑。

2.2 對照品溶液的配制與標準曲線的繪制

2.2.1沒食子酸對照品溶液的配制與標準曲線的繪制 精密稱取10 mg沒食子酸對照品溶解后,放入10 mL量瓶中定容,再精密量取0.75、1.5、2.25、3、3.75 mL分別定容到10 mL量瓶中,得到?jīng)]食子酸溶液75、150、225、3、3.75 μg·mL-1。 色譜條件:色譜柱(C18,50 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇(A)-純化水溶液(B),A∶B=8∶2,等度洗脫。2 μL進樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線,y1=8 641.7x1-22 596(r=0.999 6),線性范圍為75～375 μg·mL-1。

2.2.2鹽酸小檗堿對照品溶液的配制與標準曲線的繪制 精密稱取10 mg鹽酸小檗堿對照品,溶解后定容至100 mL量瓶中,再精密量取0.5、1、1.5、2、2.5 mL分別定容至10 mL量瓶中,得到?jīng)]食子酸溶液50、100、150、200、250 μg·mL-1。色譜柱條件:色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈(A)-體積分數(shù)為2 mL·L-1的磷酸水溶液(B),梯度洗脫。2 μL進樣,以質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y),繪制標準曲線,y2=90.028x2-0.080 7(r=0.999 9),線性范圍為50～250 μg·mL-1。

2.3 方法學考察

2.3.1精密度實驗 精密稱取樣品浸膏配成10 mg·mL-1的供試品溶液,在上述色譜條件下測定沒食子酸和鹽酸小檗堿含量,重復(fù)實驗6次,計算相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)值。

2.3.2加樣回收率實驗 精密稱取樣品浸膏配成10 mg·mL-1的供試品溶液18份,每組3份,按低、中、高(16、20、24 μg·mL-1)3個水平分別加入等量的沒食子對照品,24、30、36 μg·mL-13個水平分別加入等量的沒食子對照品,在上述色譜條件下測定沒食子酸含量、鹽酸小檗堿含量,計算RSD。

2.4 消糜栓中沒食子酸、鹽酸小檗堿的提取

2.4.1單因素實驗 本研究主要考察選擇粉碎程度、料液比、浸泡時間和提取時間4個因素對消糜栓中沒食子酸、鹽酸小檗堿和浸膏得率的綜合影響。分析粉碎程度(最粗粉、粗粉、中粉、細粉),料液比(1∶10、1∶14、1∶18、1∶22 g·mL-1),浸泡時間(3、6、12、24 h),提取時間(0.5、1、2、3 h),確定其適宜的提取范圍,以浸膏得率、沒食子酸含量和鹽酸小檗堿進行考察這4個因素,考慮藥物在后期的生產(chǎn)效率以及保證藥物的有效性,以綜合評分為參考指標,更能客觀地分析實驗結(jié)果,新制定綜合評分項,即綜合評分(%)=浸膏得率×0.5+沒食子酸含量×0.15+鹽酸小檗堿×0.35。

2.4.2響應(yīng)面實驗 以單因素實驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),選擇粉碎程度(A)、料液比(B)、浸泡時間(C)、提取時間(D)為因素,以綜合評分為響應(yīng)值,用Design-Expert 8.06軟件建立4因素3水平響應(yīng)面實驗,優(yōu)化婦科消糜栓的最佳提取工藝,實驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素與水平

2.5 數(shù)據(jù)分析

用Graph prism 8.0.4對所得數(shù)據(jù)進行處理,用Design-Expert 8.0.6.1進行響應(yīng)面分析,每組實驗重復(fù)3次并取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 婦科消糜栓含量測定及方法學驗證

方法學驗證結(jié)果顯示,精密度實驗RSD值為1.3%<2%(n=6),表明精密度良好;加樣回收率實驗的低、中、高各個水平的回收率的RSDs值分別為0.72%、0.83%、0.95%(沒食子酸對照品組),0.92%、0.86%、1.58%,均小于2%。表明該方法具有良好的準確度。見圖1。

圖1 沒食子酸含量測定的色譜圖

3.2 單因素實驗結(jié)果

3.2.1粉碎程度對婦科消糜栓提取的影響 見圖2A。從圖2A可知,隨著粉碎程度的增加,綜合評分呈先增加后減小趨勢。中粉時,浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒食子酸含量達到最高,綜合評分最高,而且中粉與粗粉之間的差異極顯著,中粉與細粉之間的差異顯著。粉碎程度會影響有效成分的浸出,但是細粉之間分子間距較小,流動速度慢,會降低溶劑滲入,導致提取效率及綜合評分降低等。因此,消糜栓藥材的最佳粉碎程度為中粉。

3.2.2提取時間對婦科消糜栓提取的影響 見圖2B。從圖2B可知,隨著消糜栓提取時間的增加,綜合評分呈先增加后減小趨勢。提取時間為2 h時,浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒食子酸含量達到最高,綜合評分最高。而且提取2 h與1 h、2 h與3 h之間的差異極顯著。提取時間為3 h時,綜合評分降低,這可能是因為提取時間增加會增加雜質(zhì)成分,影響質(zhì)量分數(shù),會間接影響有效成分。可見,最佳提取時間為2 h。

3.2.3料液比對婦科消糜栓提取的影響 見圖2C。從圖2C可知,隨著料液比的增加,綜合評分呈先增加后減小趨勢。料液比為1∶18 g·mL-1時,浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒食子酸含量達到最高,綜合評分最高。而且料液比1∶18 g·mL-1與1∶14 g·mL-1、1∶18 g·mL-1與1∶22 g·mL-1之間的差異極顯著。這可能是因為剛開始隨著溶劑量增加,有效成分不斷滲出,此時再增加料液比,可能會影響其他雜質(zhì)的含量,可能這些雜質(zhì)會降低有效成分含量。

3.2.4浸泡時間對婦科消糜栓提取的影響 見圖2D。從圖2D可知,隨著浸泡時間的延長,綜合評分呈先增加后減小趨勢。浸泡時間為12 h時,浸膏得率、鹽酸小檗堿、沒食子酸含量達到最高,綜合評分最高。而且提取12 h與6 h、12 h與24 h之間的差異極顯著。浸泡時間為12 h時,綜合評分降低,這可能是因為浸泡時間延長會增加雜質(zhì)成分、色素的浸出,影響質(zhì)量分數(shù),間接影響有效成分。可見最佳浸泡時間為2 h。

圖2 粉碎程度、提取時間、料液比、浸泡時間對婦科消糜栓綜合評分(鹽酸小檗堿、沒食子酸含量、浸膏得率)的影響(n=3)

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

3.3.1響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以粉碎程度、料液比(g·mL-1)、浸泡時間(h)、提取時間(h)為實驗因素,沒食子酸含量、浸膏得率、鹽酸小檗堿含量、綜合評分為響應(yīng)值,設(shè)計4因素3水平對婦科消糜栓的提取工藝進行優(yōu)化,其設(shè)計與結(jié)果顯示如表2所示。在此基礎(chǔ)上對回歸模型進行方差分析,結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面法分析實驗結(jié)果

3.3.2模型的建立與統(tǒng)計分析 通過Design-Expert8.0.6軟件對上述表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到婦科栓劑消糜栓,得到了以綜合評分(Y)為響應(yīng)值對編碼自變量A粉碎程度、B料液比(g·mL-1)、C浸泡時間(h)、D提取時間(h)的四元二次回歸分析。得到了綜合評分(Y)為響應(yīng)值的回歸方程:Y=-2 985.26-5.11A-605.09B-1 927.65C-61.77D-0.89AB+0.27AC-1.19AD-5.59BC-3.37BD-15.31CD-4.37A2-66.01B2-563.9C2-5.4D2。

表3 方差分析結(jié)果

圖3 浸泡時間與提取時間交互作用對婦科消糜栓綜合評分影響的響應(yīng)面及等高線圖(n=3)

3.3.4驗證實驗 根據(jù)響應(yīng)面回歸模型預(yù)測婦科消糜栓提取的最佳條件為:粉碎程度為中粉,料液比為1∶19 g·mL-1,浸泡時間為12 h,提取時間為2 h,此時婦科消糜栓按照上述計算公式得最終理論預(yù)測值為26.023 7。并在此最優(yōu)配方下進行3次平行實驗驗證,可得婦科消糜栓的綜合評分為25.98,與預(yù)測值接近,證明模型可行。

4 結(jié)論與討論

婦科消糜栓中主要活性成分為沒食子酸(GA)、鹽酸小檗堿,GA還具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用, 也可通過滅活游離病毒粒子、阻礙病毒與宿主細胞結(jié)合,阻止丙型肝炎病毒(HCV) 早期的細胞侵入和感染,還通過上調(diào)p53蛋白,誘導含人瘤病毒(HPV)基因序列細胞凋亡,抑制人類宮頸上皮細胞(HPVep)的繁殖。小檗堿對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌等均具有一定的抑菌作用,在體外能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長。因此,提高上述成分的提取率是優(yōu)化提取工藝的關(guān)鍵。

本研究將婦科消糜栓的提取工藝優(yōu)化,改進傳統(tǒng)工藝,用單因素和響應(yīng)面法分析了粉碎程度、料液比、提取時間、浸泡時間對鹽酸小檗堿含量、沒食子酸含量、浸膏得率的影響,并得到了最佳提取條件,粉碎程度為中粉、料液比1∶19 g·mL-1、提取時間為2 h、浸泡時間為12 h。為今后消糜栓成型工藝、具體作用機制研究奠定基礎(chǔ)。