柚皮素基于Th1/Th2軸對妊娠高血壓大鼠癥狀的改善

臧密密,付雪蓮,李格琳

1.滄州市人民醫院妊娠糖尿病科,滄州 061000;2.滄州市人民醫院婦產科,滄州 061000;3.滄州市人民醫院產科,滄州 061000

妊娠期高血壓疾病是妊娠晚期的一種并發癥,也是一種常見妊娠相關疾病,包括妊娠高血壓(pregnancy induced hypertension,PIH)、慢性高血壓、子癇和先兆子癇[1]。PIH是孕婦、胎兒以及新生兒發病和死亡的主要原因之一,PIH發病率為7%～12%,高于世界平均發病率,嚴重影響臨床環境中母體和胎兒的預期壽命[2]。已有研究證實,PIH可改變胎兒脈管系統和心臟結構發育,并在后續生活中誘導后代血壓升高[3]。柚皮素是4′,5,7-三羥基黃烷酮,為一種天然黃烷酮,廣泛存在于柚子、橙子等柑橘類水果中,因其廣泛的生物活性備受關注[4]。研究表明,柚皮素具有多種顯著藥理特性,如抗癌、抗糖尿病及對肝腎胃、心臟和神經的保護和免疫調節作用[5]。柚皮素的多類有效活性含多種基本分子機制,涉及不同疾病多個水平細胞信號通路融合,因此,柚皮素在治療不同疾病方面具有巨大潛力[6]。本研究通過建立PIH模型,研究柚皮素對PIH大鼠及子代生長的影響,為柚皮素有關藥物開發和臨床應用提供新方向。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific有限公司;化學發光凝膠成像系統(Fluor Chem FC3)購自美國Protein Simple公司。

1.2 試藥

柚皮素(質量分數≥98%,貨號480-41-1)購自武漢恒和達生物醫藥有限公司;硝苯地平片(國藥準字H44023986)購自廣東華南藥業集團有限公司;干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ,貨號SBJ-R0041)、白細胞介素12(interleukin-12,IL-12,貨號SBJ-R0658)及白細胞介素10(interleukin-10,IL-10,貨號SBJ-R0095)ELISA試劑盒,均購自南京森貝伽生物科技有限公司;白細胞介素33(interleukin-33,IL-33,貨號ab236714))ELISA試劑盒、兔抗鼠Th1淋巴細胞趨化因子C-X-C-基元受體3(Chemokine C-X-C-primitive receptor 3,CXCR3,貨號ab288437)、C-C趨化因子受體5(CC-chemokine receptor 5,CCR5)多抗(貨號ab65850)、Th2淋巴細胞C-趨化因子C受體類型3(C-chemokine C receptor type 3,CCR3)多抗(貨號ab32512),均購自美國Abcam公司。

1.3 實驗動物

80只SPF級SD雌性大鼠和40只雄性大鼠,體質量為180～220 g,8周齡,購自南通藥明康德醫藥科技有限公司,許可證號為SCXK(蘇)2019-0008,室內溫度24 ℃±1 ℃,空氣相對濕度為55%±5%,光照晝夜交替循環12 h,飼養1周。

2 方法

2.1 建模與分組

60只雌性大鼠經高脂高糖飲食喂養4周后,與雄性大鼠合籠過夜(雌雄比例2∶1),次日,顯微鏡觀察雌性大鼠陰道處出現精子或黏液栓現象,即妊娠成功,記為妊娠第1天,取妊娠成功51只雌性大鼠,妊娠15 d后開始靜脈注射亞硝基左旋精氨酸甲酯(80 mg·kg-1·d-1),持續15 d,誘導建立妊娠期高血壓PIH模型[7-8]。妊娠30 d后用無創尾動脈血壓監測器測量血壓,其收縮壓超過原基礎血壓30 mmHg、舒張壓超過原基礎血壓15 mmHg,即造模成功[9]。取建模成功的43只大鼠,隨機剔除3只后分為模型組、柚皮素低劑量組、柚皮素高劑量組和陽性藥物組,每組各10只。剩余雌性大鼠正常飲食和妊娠,成功妊娠13只,隨機剔除3只后為對照組,于妊娠15 d后靜脈注射等體積生理鹽水,每日1次,持續15 d。

2.2 干預方法

建模成功后,依據參考文獻[10]用量,柚皮素低、高劑量組和陽性藥物組灌胃給藥分別為50 、100 mg·kg-1柚皮素溶液及50 mg·kg-1硝苯地平溶液,對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水0.5 mL,每日1次,共計6周。

2.3 常規指標檢測

末次給藥后24 h,通過代謝籠收集大鼠次日8點至第2天8點24 h尿液,量杯計算總尿量,混勻后離心(4 000 r·min-1,10 min,4 ℃),取上清10 mL,用全自動生化分析儀測定24 h尿蛋白(24 h UTP),留尿結束2 h后,無創尾動脈血壓監測器測定大鼠尾動脈靜息血壓值。

2.4 血清炎性因子檢測

常規指標檢測結束后,取大鼠腹部主動脈血,離心取上清(3 000 r·min-1,10 min),ELISA法檢測血清IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-33含量。設置對照品孔和樣本孔,對照品孔加不同質量濃度對照品100 μL,樣本孔先加5倍稀釋的上清液100 μL,后于各孔加入HRP標記的抗體,37 ℃溫育1 h,洗板,加入底物A、B避光孵育15 min,50 μL終止液終止反應,酶標儀測定450 nm處吸光度值,根據標準曲線計算大鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-33含量。

2.5 觀測仔鼠體質量、產仔數量及死亡率

大鼠妊娠期結束后,記錄生產的仔鼠數量和體質量,并計算其死亡率。

2.6 腎組織CXCR3等指數水平檢測

處死大鼠,無菌摘取腎組織,勻漿,Trizol法提RNA,測定質量分數、質量濃度,逆轉錄得cDNA,實時熒光定量PCR反應。反應體系:Taq聚合酶1.6 μL ,上下游引物各0.6 μL,模板cDNA 1 μL, 雙蒸水16.2 μL,擴增條件為預變性(95 ℃,30 s)、變性(95 ℃,5 s)、退火(59 ℃,30 s),共40個循環,加熔解曲線,降溫(50 ℃,30 s)。以GAPDH為內參對照,檢測CXCR3、CCR5、CCR3 mRNA水平,數據分析用2-△△Ct法,重復多次,取Ct均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 腎組織CXCR3等蛋白水平檢測

處死大鼠,取腎組織,加RIPA裂解緩沖液,離心取上清(7 000 r·min-1,10 min,離心半徑為20 cm),蛋白BCA試劑盒測定總蛋白質量濃度,加熱變性蛋白,統一蛋白上樣量,用SDS-PAGE凝膠電泳將待測蛋白樣品電泳分離(100 V,80 min),轉至PVDF(250 mA),用體積分數為5%的脫脂牛奶磷酸鹽緩沖液封閉(2 h),將樣品與CXCR3(1∶250)、CCR5(1∶250)、CCR3(1∶250)一抗4 ℃過夜孵育,TBST緩沖液洗膜,加二抗HRP標記IgG室溫孵育(1∶2 000,2 h),洗膜,曝光,顯影。Image J軟件測樣品與GAPDH條帶灰度值。計算目標(CXCR3、CCR5及CCR3)蛋白相對表達水平,即目標條帶與GAPDH條帶灰度比值。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 常規指標水平

雌性大鼠24 h UTP、收縮壓及舒張壓組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組24 h UTP、收縮壓及舒張壓升高(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低、高劑量組、陽性藥物組24 h UTP、收縮壓及舒張壓降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽性藥物組24 h UTP、收縮壓及舒張壓降低,且陽性藥物組低于柚皮素高劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 常規指標水平比較

3.2 血清相關炎性因子水平

血清IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-33水平組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組血清IFN-γ、IL-12升高,IL-10、IL-33水平降低(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低劑量、高劑量組、陽性藥物組血清IL-10、IL-33水平升高,IFN-γ、IL-12水平降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽性藥物組血清IL-10、IL-33水平升高,IFN-γ、IL-12水平降低(P<0.05);與柚皮素高劑量組比較,陽性藥物組血清IL-10、IL-33水平升高,IFN-γ、IL-12水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 血清IFN-γ、IL-12、IL-10及IL-33水平比較

3.3 仔鼠出生數量和體質量及死亡率

仔鼠出生數量和體質量及死亡率組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組仔鼠出生數量和體質量增加、死亡率升高(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低劑量、高劑量組及陽性藥物組仔鼠出生數量和體質量減少、死亡率降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽性藥物組血清仔鼠出生數量和體質量減少、死亡率降低,且陽性藥物組低于柚皮素高劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 仔鼠出生數量、體質量及死亡率比較

3.4 腎組織相關因子mRNA水平

腎組織CXCR3、CCR5及CCR3 mRNA水平組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組CXCR3、CCR5 mRNA水平升高,CCR3 mRNA水平降低(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低劑量、高劑量組及陽性藥物組CCR3 mRNA水平升高,CXCR3、CCR5 mRNA水平降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽性藥物組CCR3 mRNA水平升高,CXCR3、CCR5 mRNA水平降低(P<0.05);與柚皮素高劑量組比較,陽性藥物組CCR3 mRNA水平升高,CXCR3、CCR5 mRNA水平降低(P<0.05)。見表5。

表5 腎組織CXCR3、CCR5、CCR3 mRNA水平比較

3.5 腎組織相關蛋白水平

腎組織CXCR3、CCR5及CCR3蛋白水平組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較,模型組CXCR3、CCR5蛋白水平升高,CCR3蛋白水平降低(P<0.05);與模型組比較,柚皮素低、高劑量組、陽性藥物組CCR3蛋白水平升高,CXCR3、CCR5蛋白水平降低(P<0.05);與柚皮素低劑量組比較,柚皮素高劑量組、陽性藥物組CCR3蛋白水平升高,CXCR3、CCR5蛋白水平降低(P<0.05);與柚皮素高劑量組比較,陽性藥物組CCR3蛋白水平升高,CXCR3、CCR5蛋白水平降低(P<0.05)。見表6、圖1。

表6 腎組織CXCR3、CCR5及CCR3蛋白水平比較

注:A.對照組;B.模型組;C.柚皮素低劑量組;D.柚皮素高劑量組;E.陽性藥物組。

4 討論

PIH是一種典型的以妊娠后半期新發高血壓為特征的疾病,是各種生理病理變化中最常見的不利于子宮環境的疾病之一[11]。目前,胰島素抵抗、腎素-血管緊張素-醛固酮系統功能障礙、炎癥、肥胖引起神經體液和腎臟機制相互作用已被認為是PIH的促成因素,但其機制尚不明確[2]。

妊娠期的正常細胞環境包括來自先天免疫和適應性免疫的促炎和抗炎成分[12],與以Th2和Treg細胞反應和細胞因子譜占主導地位的Th2型免疫狀態為特征的正常妊娠相反,PIH由于Th1型免疫和促炎細胞因子而占優勢[13],當機體免疫功能受損、Th1/Th2平衡狀態被打破時,會導致Th1/Th2細胞失衡引起妊娠期相關疾病發生[14-15]。Th1驅動反應由Th1淋巴細胞產生促炎細胞因子介導,如IL-12、IFN-γ和腫瘤壞死因子-α;而Th2驅動反應由抗炎細胞因子介導,如IL-4、1L-10和1L-33等,可用于評估機體免疫狀態[16-17]。本研究結果表明,與模型組比較,柚皮素各劑量組血清IL-10、IL-33水平升高,24 h UTP、收縮壓、舒張壓指標、血清IFN-γ、IL-12水平、仔鼠死亡率降低,仔鼠出生數量和體質量減少,表明用柚皮素進行干預后,可有效調節PIH大鼠血壓,減輕炎性反應,緩解對子代生長影響,修復Th1/Th2細胞免疫平衡。

Th1/Th2失衡已被認為是自身免疫性疾病的發病機制之一[18]。研究發現,趨化因子受體CXCR3和CCR5主要在Th1型淋巴細胞上表達,而CCR3受體則在Th2型淋巴細胞上表達,且CXCR3、CCR5和CCR3已作為區分Th1/Th2型淋巴細胞標記,這些受體與趨化細胞因子相結合,在許多生理病理過程中發揮著至關重要的作用[19]。已有研究表明,由T細胞亞群功能失調性失衡介導的免疫疾病可能與免疫血小板減少癥改變有關,此外,Th1/Th2趨化因子受體異常表達可能在肝硬化和脾功能亢進的脾免疫疾病中發揮作用,這反過來又可以解釋外周血細胞減少癥,因此,Th1/Th2趨化因子受體的異常表達可能在自身免疫疾病中發揮作用[20]。本研究結果顯示,與模型組比較,柚皮素低劑量組、柚皮素高劑量組腎組織CCR3 mRNA和蛋白水平升高,CXCR3、CCR5 mRNA和蛋白水平降低,表明柚皮素可能通過調節Th1/Th2軸關鍵分子表達減輕PIH疾病,降低機體自身免疫功能損傷。

綜上所述,柚皮素能夠調節血壓,改善PIH大鼠炎性反應和機體免疫功能損傷,調控Th1/Th2細胞免疫平衡,其作用機制可能與Th1/Th2軸激活有關,可為臨床治療PIH提供參考。