姜黃素改善七氟烷致老年大鼠認知功能障礙的機制

李小娜,樊少卿,趙二賢,許宏俠

1.河南中醫藥大學第二附屬醫院日間手術室,鄭州 450002;2.鄭州大學第一附屬醫院麻醉與圍術期醫學部,鄭州 450000;3.河南大學第一附屬醫院老年病科,開封 475000

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是術后常見的并發癥,多發于中老年患者且集中發生于術后1周左右[1]。七氟烷吸入麻醉因術后蘇醒平穩、迅速,對肝腎循環影響較小和對呼吸道作用溫和等,故常用于老年患者的麻醉[2]。但七氟烷會對神經系統造成一定程度的損傷,且嚴重影響海馬區神經細胞,導致患者出現認知功能障礙、學習能力減退等癥狀[3],對術后預后的影響極大。姜黃素(curcumin)是一種多酚類物質,提取自姜黃、郁金、莪術的根莖,具有抗炎、抗腫瘤、抗凋亡、調節血脂等藥理作用[4]。姜黃素能夠通過減輕炎癥反應,緩解神經損傷,但其機制尚不明確[5]。本研究通過建立POCD大鼠模型,探討姜黃素對認知功能障礙的修復作用及可能的作用機制,為姜黃素藥物的開發及POCD的臨床治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SpectraMax M5型多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司);熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);Hema9500型基因擴增儀(廣東黑馬醫學儀器有限公司)。

1.2 試藥

姜黃素(質量分數≥98%,上海易恩化學技術有限公司);腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒,均購自北京雅安達生物科技有限公司;兔抗鼠β-actin多克隆抗體,兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)多克隆抗體,山羊抗兔二抗IgG,均購自北京雅安達生物科技有限公司。

1.3 動物

60只18月齡SPF級雄性SD大鼠,體質量220～250 g,由浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供,合格證號:SCXK(浙)2019-0001。飼養條件:光/暗周期12 h,溫度(22±2) ℃,環境相對濕度為50%±10%。適應性飼養7 d,可自由獲取食物和水,墊料每日進行更換。實驗過程中對動物的各種處置均符合實驗動物委員會有關動物的使用及倫理學規定。

2 方法

2.1 造模與分組

60只18月齡SD雄性大鼠隨機分為模型組(12只)、姜黃素低劑量組(12只)、姜黃素中劑量組(12只)和姜黃素高劑量組(12只),另設對照組(12只)。每日上午同一時間,姜黃素低、中和高劑量組分別用50、150和300 mg·kg-1姜黃素混懸液[6-8](用生理鹽水配制)灌胃,對照組及模型組給予等量生理鹽水灌胃。每日下午同一時間,采用七氟烷吸入麻醉法建立POCD模型[9],將所有大鼠放入麻醉箱,除對照組外麻醉箱內以空氣為載體,流速設置為2 L·min-1,持續時長為3 h,對照組大鼠置于麻醉箱內,給予同流速空氣,每日1次,連續處理14 d。

2.2 標本采集

末次給藥后,腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉,翻正反射消失后,迅速打開腹腔。經腹主動脈采集血液,靜置30 min,于4 ℃下以3 000 r·min-1離心15 min,分離血清,-20 ℃保存。冰上斷頭處死大鼠,打開頭骨,完整取出大鼠腦組織。使用預冷的生理鹽水沖洗血液,快速分離出海馬組織,將部分海馬組織浸入多聚甲醛溶液中固定24 h備用,剩余海馬組織封存于無菌凍存管內,-80 ℃保存備用。

2.3 Morris水迷宮實驗

分別于給藥后1、3和7 d,待大鼠清醒后進行Morris水迷宮實驗測定大鼠學習記憶能力,每日5次,每次間隔5 min。水溫設定為22～26 ℃,依次將大鼠從4個象限入水點放入水中,記錄大鼠找到隱藏平臺的時間,該時長即為逃避潛伏期。當大鼠到達平臺時,攝像系統停止拍照記錄,整理并分析大鼠逃避時長。撤去平臺,使大鼠重新入水,自由游泳120 s,記錄大鼠穿越平臺的次數。實驗過程中,保持室溫與水溫一致,室內環境相同,以排除環境因素的干擾。

2.4 血清炎癥因子水平測定

取大鼠血清,室溫靜置20 min,按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒說明書中的步驟操作,先設置對照孔與樣本孔,于對照孔中加入不同質量濃度的對照品50 μL,樣本孔中加入樣品稀釋液40 μL。每孔中再加入酶標試劑100 μL,密封酶標板,37 ℃孵育60 min。甩干廢液,加入20倍稀釋洗滌液,反應5 s,清洗5次。每孔中加入顯色劑A與B,37 ℃避光孵育20 min,再于每孔中加入終止液終止反應。15 min內用全波長酶標測試儀檢測各孔450 nm處的吸光度值,根據對照品質量濃度繪制標準曲線,計算樣品的質量濃度。

2.5 海馬組織HE染色觀察

取已固定的海馬組織,用PBS溶液洗滌3次,梯度乙醇脫水,置于二甲苯中透明。再分別將組織浸入軟蠟和硬蠟中進行包埋,待石蠟完全凝固后取出包埋盒,使用切片機先將組織石蠟塊粗略修形,再切成厚度為5 μm的薄片,展片晾干,置于37 ℃下烘烤過夜。滴加蘇木精染色溶液染色2 min,流水清洗,鹽酸乙醇溶液分化,流水清洗,伊紅乙醇溶液浸染1 min,流水沖洗,再次脫水透明,最后用中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察海馬組織的病理變化,采集圖像進行分析。

2.6 海馬組織TUNEL染色

取出制備好的海馬組織切片,置于室溫平衡溫度后,用PBS溶液洗滌3次。放入用Triton X與檸檬酸鈉配制的滲透液中10 min,PBS溶液沖洗,添加TUNEL反應混合物,37 ℃孵育60 min,PBS溶液洗滌3次,每次3 min,浸入DAPI培養液中15 min,使用熒光顯微鏡拍攝圖像,觀察海馬組織神經細胞的凋亡情況,統計細胞總數量和細胞核呈棕黃色或棕褐色的凋亡陽性細胞數量,計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=(陽性細胞數量/總細胞數量)×100%。

2.7 PI3K、AKT、GSK3β mRNA的表達水平

將海馬組織研磨后置于EP管內,根據海馬組織量加入RNAAiso Plus,適當吹打后進行勻漿處理,4 ℃以12 000 r·min-1離心15 min提取總RNA。用分光光度計檢測RNA質量分數并計算最終質量分數。配制反轉錄反應體系合成cDNA,完成逆轉錄的cDNA樣品用于配制20 μL反應體系進行PCR擴增,按照說明書配制相應的cDNA Real-PCR,引物序列見表1。配制QPCR-20 μL反應體系:2×SuperReal PreMix Plus 10 μL,上、下游引物各0.6 μL,50×ROX Reference Dye 2.0 μL,DNA模板1.0 μL,過氧化氫5.8 μL。反應條件:95 ℃預變性15 min,95 ℃ 10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,40個循環。擴增反應結束后,讀取各樣本與內參基因的Ct值,用2-△△CT法計算各樣本中各基因的相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列

2.8 PI3K、AKT、GSK3β蛋白的表達水平

將海馬組織剪碎后加入RIPA裂解液,充分裂解30 min,4 ℃以12 000 r·min-1離心15 min,吸取上清液用BCA蛋白試劑盒檢測總蛋白濃度。確定蛋白上樣量,將40 μg蛋白樣品加入聚苯烯酰胺凝膠中,恒壓120 V電泳至溴酚藍底部。轉至PDVF膜上并置于脫脂奶粉中封閉60 min,加入一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液清洗3次,每次10 min。加入二抗(1∶5 000),室溫孵育60 min,用TBST緩沖液清洗3次,每次10 min。滴加ECL顯色A液和B液,置于暗室中顯影和定影,以β-actin為內參,計算相應蛋白的表達量。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 Morris水迷宮行為學評分的比較

與對照組比較,模型組大鼠術后1、3和7 d逃避潛伏期明顯延長,跨臺次數減少(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素高、中、低劑量組大鼠術后1、3和7 d逃避潛伏期明顯縮短,跨臺次數增加(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中劑量組和高劑量組大鼠術后1、3和7 d逃避潛伏期明顯縮短,跨臺次數增多,且高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮行為學評分的比較

3.2 血清炎癥因子水平的比較

與對照組比較,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平升高(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素低、中和高劑量組大鼠3項指標均降低(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中、高劑量組大鼠3項指標均降低,且高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結果見表3。

表3 各組血清炎癥因子水平的比較

3.3 HE染色結果的比較

對照組大鼠海馬組織CA1區神經細胞的結構完整、清晰,排列緊密有序,神經元數量較多,結構完整;細胞核呈藍紫色,細胞質呈淡紫色,染色均勻。模型組大鼠海馬組織CA1區神經細胞的結構被破壞,排列散亂無序,神經元數量減少,細胞核皺縮明顯,染色不均。與模型組比較,姜黃素低、中和高劑量組大鼠海馬組織CA1區神經細胞結構受損的現象得到改善,可見神經細胞結構較清晰、完整,排列緊密,神經元數量增多,結構較為完整。結果見圖1。

注:A.對照組;B.模型組;C.姜黃素低劑量組;D.姜黃素中劑量組;E.姜黃素高劑量組。

3.4 神經細胞凋亡率的比較

與對照組比較,模型組大鼠海馬組織CA1區神經細胞的凋亡率升高(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素高、中、低劑量組大鼠海馬組織CA1區神經細胞的凋亡率降低(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中和高劑量組大鼠海馬組織CA1區神經細胞的凋亡率降低,且高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結果見表4、圖2。

注:A.對照組;B.模型組;C.姜黃素低劑量組;D.姜黃素中劑量組;E.姜黃素高劑量組。

表4 大鼠海馬組織神經細胞凋亡率的比較

3.5 PI3K、AKT、GSK3β mRNA水平的比較

與對照組比較,模型組大鼠海馬組織PI3K和AKT mRNA的表達水平降低,GSK3βmRNA的表達水平升高(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素高、中、低劑量組大鼠海馬組織PI3K和AKT mRNA的表達水平升高,GSK3βmRNA的表達水平降低(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中劑量組和高劑量組大鼠海馬組織PI3K和AKT mRNA的表達水平升高,GSK3βmRNA的表達水平降低,且姜黃素高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結果見表5。

表5 大鼠海馬組織PI3K、AKT、GSK3β mRNA水平的比較

3.6 PI3K、AKT、GSK3β蛋白水平的比較

與對照組比較,模型組大鼠海馬組織PI3K和p-AKT蛋白的表達水平降低,p-GSK3β蛋白的表達水平升高(P<0.05)。與模型組比較,姜黃素高、中、低劑量組大鼠海馬組織PI3K和p-AKT蛋白的表達水平升高,p-GSK3β蛋白的表達水平降低(P<0.05)。與姜黃素低劑量組比較,姜黃素中劑量組和高劑量組大鼠海馬組織PI3K和p-AKT蛋白的表達水平升高,p-GSK3β蛋白的表達水平降低,且姜黃素高劑量組的變化更為明顯(P<0.05)。結果見表6、圖3。

圖3 海馬組織蛋白表達水平

表6 大鼠海馬組織PI3K、p-AKT、p-GSK3β蛋白水平的比較

4 討論

吸入性麻醉藥物與靜脈注射麻醉藥物相比,更易引起POCD,可導致神經細胞凋亡和學習記憶功能減退,藥物濃度越大神經元凋亡越嚴重,且范圍越大[10-12]。炎癥反應和神經細胞凋亡是引起神經系統發生老化,即認知功能減退的中心環節[13]。姜科植物姜黃是一種傳統中藥,姜黃素作為其特有的活性成分,對中樞神經系統損傷有較好的修復作用,還可減輕機體的炎癥反應[14-15]。姜黃素對神經細胞凋亡亦有抑制作用[16]。

本研究用七氟烷吸入麻醉法建立POCD大鼠模型,從分子機制上探討姜黃素對POCD大鼠認知功能障礙的修復作用及其對海馬組織神經細胞凋亡的影響。結果顯示,模型組大鼠在Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期延長,跨臺次數明顯減少,血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,表明模型組大鼠認知功能障礙模型建立成功且伴有炎癥反應。在給予不同劑量的姜黃素治療后,大鼠均表現逃避潛伏期縮短,跨臺次數明顯增多,血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低,表明大鼠認知功能障礙得到改善,且體內炎癥反應減輕。觀察海馬組織HE染色切片也發現,海馬組織CA1區神經元數量增多,細胞凋亡現象得到改善。

PI3K/AKT/GSK3β信號通路在中樞神經系統中可改善神經炎癥,抑制神經細胞凋亡,是典型的抗炎、抗凋亡通路之一[17-18]。PI3K活化可激活下游因子AKT,而絲氨酸蛋白激酶參與細胞增殖、存活和凋亡等多種生理過程[19]。p-AKT作為GSK3β的負調節因子,能夠下調GSK3β從而降低凋亡蛋白相關因子的水平,起到抑制細胞凋亡的作用[20]。在本研究中,與模型組比較,姜黃素各劑量組大鼠海馬組織中PI3K、AKT mRNA和蛋白的表達水平升高,GSK3βmRNA和蛋白的表達水平均降低,且海馬組織CA1區神經細胞的凋亡率降低,表明姜黃素能夠激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路,抑制POCD大鼠細胞凋亡,發揮神經保護作用。

綜上所述,姜黃素能夠改善七氟烷致POCD大鼠的認知功能障礙,減輕炎癥反應,降低神經細胞凋亡率,可能是通過激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路發揮作用,為臨床治療POCD提供實驗依據。