大蒜素對(duì)感染性休克大鼠腦的保護(hù)作用

劉建東,陳清云,于峰偉,孫爭宇

1.駐馬店市中醫(yī)院康復(fù)科,駐馬店 463000;2.河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,鄭州 450000

感染性休克為臨床常見危重癥之一,又被稱為內(nèi)毒素/膿毒性休克,病理特征包括低血壓、低血氧癥、代謝性酸中毒、全身性炎癥反應(yīng)等[1]。感染性休克發(fā)病后可累及多個(gè)臟器,導(dǎo)致肝腎功能減退、心功能不全、肺水腫等改變,且可造成腦組織缺氧、缺血,影響中樞神經(jīng)系統(tǒng),引發(fā)腦損傷[2]。其中,腦內(nèi)促炎因子與抗炎因子平衡失調(diào)是感染性休克導(dǎo)致腦損傷的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[3]。因此,加強(qiáng)感染性休克患者早期干預(yù)、減輕炎性反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)、保護(hù)腦組織功能,已逐漸成為重癥醫(yī)學(xué)科研究的重點(diǎn)之一。大蒜素是一種常見的二烯丙基三硫化物,具有多種藥理作用,如抗炎、抗氧化、抗凋亡等[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)[5],大蒜素能對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化進(jìn)行抑制,控制腦缺血再灌注大鼠炎性反應(yīng),減輕腦損傷,但就其對(duì)感染性休克患者腦損傷保護(hù)作用及機(jī)制的研究仍較少。本研究開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn),分析大蒜素對(duì)感染性休克大鼠腦損傷的保護(hù)作用,并探討其機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BX51-P型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社);ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BioTek公司);GelDoc型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

大蒜素注射液(黑龍江迪龍制藥有限公司);磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路抑制劑LY294002[凱梅根(上海)生物科技有限公司];腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-8,IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒均購自上海晶抗生物工程有限公司;TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TdT mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒(北京索來寶科技有限公司);二奎啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)蛋白試劑盒(湖北武漢富鑫遠(yuǎn)科技有限公司);兔抗大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR一抗及山羊抗兔IgG二抗均購自德國羅氏診斷有限公司。

1.3 動(dòng)物

選取60只健康SD雄性大鼠,7周齡,體質(zhì)量260～280 g,購自北京天誠醫(yī)藥科技有限公司,許可證號(hào):SYXK(京)2016-0047。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,溫度(22±2) ℃,濕度55%～60%,12 h光照,自由飲水,普通飼料喂養(yǎng)。本研究動(dòng)物處置符合“3R”標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 模型制備與分組

60只大鼠中隨機(jī)取10只作為正常組,剩余50只建立感染性休克大鼠模型[6]。建模方法:大鼠用戊巴比妥鈉50 mg·kg-1(2.5 mL·g-1)腹腔注射麻醉,仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上。取右腹股溝正中切口,逐層分離皮膚、皮下組織,游離右股動(dòng)脈,近心端以動(dòng)脈夾夾閉,留置針穿刺股動(dòng)脈,松開動(dòng)脈夾,觀察出現(xiàn)血液回流,即為穿刺成功,隨后經(jīng)尾靜脈注入內(nèi)毒素(5 mg·kg-1溶于5 mL生理鹽水)。建模成功標(biāo)準(zhǔn):內(nèi)毒素注入后2 h平均動(dòng)脈壓<5.3 kPa(1 kPa=75 mmHg),且維持2～3 h以上,同時(shí)出現(xiàn)少尿、皮膚發(fā)紺、躁動(dòng)不安等表現(xiàn)。50只大鼠建模成功42只,成功率為84.00%。將42只大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)、大蒜素組(10只)、抑制劑組(11只)、抑制劑+大蒜素組(11只)。正常組大鼠術(shù)中僅穿刺,不注入內(nèi)毒素,其余步驟同上,10只大鼠均納入研究。

2.2 動(dòng)物干預(yù)

建模成功后立即開始治療。大蒜素使用前用生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的溶液。大蒜素組大鼠按照10 mL·kg-1體質(zhì)量,以質(zhì)量濃度5 mg·mL-1大蒜素溶液腹腔注射;抑制劑組大鼠按照10 mL·kg-1體質(zhì)量,以質(zhì)量濃度5 mg·mL-1LY294002腹腔注射;抑制劑+大蒜素組大鼠按照10 mL·kg-1體質(zhì)量,以質(zhì)量濃度5 mg·mL-1LY294002+質(zhì)量濃度5 mg·mL-1大蒜素混合液腹腔注射,正常組和模型組大鼠以10 mL·kg-1體質(zhì)量生理鹽水腹腔注射,均為單次給藥。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)估

各組治療后24 h,以神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(Neurological Severity Scores,NSS)評(píng)估神經(jīng)功能損傷情況[7]:0分,神經(jīng)功能無明顯異常,活動(dòng)正常;1分,癱瘓側(cè)前肢不能充分伸展;2分,活動(dòng)時(shí)不自覺向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn);3分,活動(dòng)時(shí)不自覺向癱瘓側(cè)傾倒;4分,意識(shí)喪失。

2.4 取材與處理

完成神經(jīng)功能評(píng)估后,以戊巴比妥鈉50 mg·kg-1(2.5 mL·g-1)腹腔注射麻醉,斷頭處死,取腦,輕柔剝?nèi)‰p側(cè)腦海馬組織,分為4份。2份置于液氮中保存,2份置于質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛中固定。

2.5 炎性指標(biāo)檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)。取1份保存于液氮中的腦海馬組織,用生理鹽水反復(fù)沖洗,冰浴下制備組織勻漿。4 ℃以12 000 r·min-1離心10 min,離心半徑8 cm,取上清液。嚴(yán)格按照TNF-α、IL-6、IL-1β試劑盒說明書操作,記錄450 nm處的吸光度值,分別以吸光度值、對(duì)照品濃度作為縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)本吸光度值計(jì)算指標(biāo)濃度。

2.6 腦海馬神經(jīng)元凋亡檢測(cè)

采用TUNEL熒光染色法檢測(cè)腦海馬神經(jīng)元凋亡情況。取1份用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定的腦海馬組織,常規(guī)石蠟包埋,切片厚4 μm。嚴(yán)格按照TUNEL染色試劑盒說明書操作,顯微鏡400倍視野下隨機(jī)選擇4個(gè)視野。TUNEL染色凋亡細(xì)胞呈綠色熒光,計(jì)算神經(jīng)元凋亡率。神經(jīng)細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量)×100%。

2.7 海馬CA1區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)

采用HE染色法檢測(cè)海馬CA1區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)。取1份用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定的腦海馬組織,用生理鹽水沖洗,磷酸緩沖液浸泡10 h。脫水,石蠟包埋,切片厚4 μm,用烤片機(jī)烤干。二甲苯透明,梯度乙醇脫蠟,流水沖洗。蘇木精染色5 min,鹽酸乙醇分化,流水沖洗30 min。伊紅染色3 min,流水沖洗。梯度乙醇脫蠟,二甲苯透明,中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)組織病理形態(tài)學(xué)。

2.8 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量。取1份保存于液氮中的腦海馬組織,用磷酸緩沖液清洗2次,加RIPA裂解液反應(yīng)30 min。4 ℃以12 000 r·min-1離心10 min,離心半徑8 cm,取上清液。用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),加入2×上樣緩沖液,沸水浴變性10 min。用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,加質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂奶粉封閉1 h。加兔抗大鼠PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin(1∶1 000)一抗,室溫下孵育2 h。TBST洗膜4次,每次10 min。加ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑,Image Quant LAS4000生物分子成像儀顯影曝光。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶的灰度值/β-actin條帶的灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能比較

各組大鼠NSS組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組大鼠的NSS升高;與模型組比較,大蒜素組大鼠的NSS降低,而抑制劑組的NSS升高;與大蒜素組比較,抑制劑+大蒜素組的NSS升高;與抑制劑組比較,抑制劑+大蒜素組大鼠的NSS降低。結(jié)果見表1。

表1 各組NSS的比較

3.2 TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較

TNF-α、IL-6、IL-1β水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量升高;與模型組比較,大蒜素組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量降低,而抑制劑組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量升高;與大蒜素組比較,抑制劑+大蒜素組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量升高;與抑制劑組比較,抑制劑+大蒜素組TNF-α、IL-6、IL-1β的含量降低。結(jié)果見表2。

表2 各組TNF-α、IL-6、IL-1β含量的比較

3.3 神經(jīng)元凋亡情況比較

神經(jīng)元凋亡率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組神經(jīng)元凋亡率升高;與模型組比較,大蒜素組神經(jīng)元凋亡率降低,而抑制劑組神經(jīng)元凋亡率升高;與大蒜素組比較,抑制劑+大蒜素組神經(jīng)元凋亡率升高;與抑制劑組比較,抑制劑+大蒜素組神經(jīng)元凋亡率降低。結(jié)果見圖1、表3。

注:A.正常組;B.模型組;C.大蒜素組;D.抑制劑組;E.抑制劑+大蒜素組。

表3 各組大鼠腦海馬神經(jīng)元凋亡率的比較

正常組腦組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞層次清晰,神經(jīng)元排列整齊,細(xì)胞質(zhì)豐富,核仁清楚;模型組和抑制劑組腦組織細(xì)胞明顯腫脹,神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏,神經(jīng)元排列較紊亂,可見空泡神經(jīng)元,其中抑制劑組的異常改變更明顯;大蒜素組和抑制劑+大蒜素組腦組織結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元排列、神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)等的異常改變減輕,其中大蒜素組的改善更顯著。結(jié)果見圖2。

注:A.正常組;B.模型組;C.大蒜素組;D.抑制劑組;E.抑制劑+大蒜素組。

3.5 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較,模型組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05);與模型組比較,大蒜素組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,而抑制劑組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低;與大蒜素組比較,抑制劑+大蒜素組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低;與抑制劑組比較,抑制劑+大蒜素組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高。結(jié)果見圖3、表4。

表4 各組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

圖3 各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白的表達(dá)水平

4 討論

感染性休克主要是由微生物及其毒素等所致的膿毒病綜合征伴休克,病死率較高[8]。感染性休克發(fā)生后可致使大量炎性因子分泌,引起血流分布改變,導(dǎo)致動(dòng)脈血壓下降、灌注不足,造成多臟器損傷[9]。其中,腦組織因自身氧儲(chǔ)備量小,成為感染性休克最易累及的器官之一,特別是腦組織海馬CA1區(qū)最為敏感[10]。既往臨床多采用西藥治療,雖在中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)方面有一定作用,但不良反應(yīng)也較多,治療安全性不高[11]。中醫(yī)認(rèn)為,感染性休克屬于“厥證”“脫證”范疇,病因有內(nèi)外之分,內(nèi)因包括毒瘀痰熱內(nèi)生,外因包括六淫毒邪、疫病之氣,主要病機(jī)為正氣不足、氣陰俱虧、氣機(jī)逆亂、臟真受損、陽脫陰竭,治療當(dāng)以清熱解毒、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主[12]。大蒜為常用中草藥之一,可清熱解毒、活血化瘀、溫中行滯,其有效成分大蒜素具有多種生物學(xué)功能,包括抗炎、抗氧化、抗菌、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抑制血小板聚集等[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道[14],大蒜素可改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分,減輕炎癥反應(yīng)及腦水腫,抑制神經(jīng)元凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn)[15],大蒜素對(duì)阿爾茨海默病大鼠的神經(jīng)元有一定保護(hù)作用,可抑制病情進(jìn)展。

研究表明,腦損傷后,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可分泌大量IL-6浸潤腦實(shí)質(zhì),而TNF-α啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),使炎癥因子不斷生成、分泌,槲皮素通過抑制炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡,降低NSS,起到腦保護(hù)作用[16]。

大蒜素是否能降低由炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞凋亡,從而改善感染性休克大鼠腦損傷仍需進(jìn)一步探討。本研究的結(jié)果顯示,應(yīng)用大蒜素后大鼠NSS,TNF-α、IL-6、IL-1β含量,神經(jīng)元凋亡率降低,HE染色顯示海馬CA1區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元排列、神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)等異常改變減輕,表明大蒜素可減輕感染性休克大鼠的炎性反應(yīng)及腦組織損傷,抑制神經(jīng)元凋亡。張昆[17]也發(fā)現(xiàn),大蒜素可改善感染性休克大鼠海馬CA1區(qū)病變及細(xì)胞凋亡,與本研究共同證實(shí)大蒜素對(duì)感染性休克腦損傷具有抑制作用。

PI3K/Akt通路在多種生理過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有調(diào)節(jié)作用,例如細(xì)胞增殖、凋亡、分化,同時(shí)在炎癥、代謝及腫瘤疾病中同樣發(fā)揮調(diào)控作用。韓睿等[18]研究發(fā)現(xiàn),血必凈注射液對(duì)缺血性腦損傷大鼠有一定神經(jīng)保護(hù)作用,可減輕炎性反應(yīng),其作用可能與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。還有學(xué)者提出[19],PI3K/Akt通路激活對(duì)由膿毒癥所致的腦損傷有抑制作用,能減輕神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制神經(jīng)元凋亡。王億龍等[20]提出,放射性腦損傷中,PI3K/Akt/mTOR通路參與神經(jīng)細(xì)胞存活、凋亡過程,激活該通路可緩解炎性反應(yīng),減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡。骨痹湯通過調(diào)節(jié)該信號(hào)通路降低血清中TNF-α和IL-1β的含量,改善骨關(guān)節(jié)炎大鼠病理癥狀[21]。以上研究提示,PI3K/Akt通路引起的炎癥反應(yīng)與感染性休克大鼠腦損傷可能存在密切關(guān)系。本研究的結(jié)果顯示,用大蒜素治療后大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,且PI3K/Akt通路抑制劑可減弱大蒜素的治療作用,表明大蒜素可激活PI3K/Akt通路,這可能是大蒜素改善感染性休克大鼠腦損傷的作用機(jī)制之一。

綜上所述,大蒜素可減輕感染性休克大鼠的炎性反應(yīng)、抑制神經(jīng)元凋亡,發(fā)揮腦損傷抑制作用,機(jī)制可能與激活PI3K/Akt通路有關(guān)。本研究的不足之處在于僅就大蒜素經(jīng)PI3K/Akt通路的作用進(jìn)行分析,未對(duì)這一通路中的多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行分子水平的探討,且未就其他途徑進(jìn)行探討,而大蒜素對(duì)感染性休克腦損傷的抑制作用是經(jīng)多途徑實(shí)現(xiàn)的,故今后仍需進(jìn)一步研究。