唑來膦酸脂質體的制備及抗腫瘤活性研究

景莎莎,梁 宇,郭潔芬,胡海洋

1.西安國際醫學中心醫院,西安 710100;2.深圳市博德維環境技術股份有限公司西安分公司,西安 710000;3.西安萬隆制藥股份有限公司,西安 710119;4.沈陽藥科大學,本溪 117004

乳腺癌是導致女性腫瘤相關死亡的主要原因之一,世界衛生組織2020年的數據顯示,乳腺癌已經取代肺癌,成為全球第一大癌癥[1],乳腺癌的治療得到了廣泛的關注與研究。

唑來膦酸(zoledronic acid,ZOL)是一種含氮雜環雙磷酸鹽,水溶性強,可抑制骨吸收[2],臨床用于治療惡性腫瘤性高鈣血癥[3]。研究發現,唑來膦酸不僅可以緩解乳腺癌骨轉移骨痛[4-5],還可以通過阻斷腫瘤微環境在發病機制中的支持作用來抑制乳腺癌的發展[6],延長總生存期[7],而且唑來膦酸和內分泌治療藥物聯合應用可以增強對人乳腺癌細胞的抑制作用[8-9],但靜脈注射大劑量唑來膦酸溶液會產生一定的腎毒性[10-11]。

脂質體具有良好的生物相容性,毒性低,被廣泛地應用于癌癥的治療中[12],抗癌藥物脂質體利用EPR效應到達腫瘤組織[13],提高藥效并減少全身不良反應[14]。包封率(encapsulation efficiency,EE)和載藥量(drug loading,DL)的高低直接決定藥物的療效[15],水溶性藥物易泄漏,包封率低[16],故提高包封率尤為重要。Box-Behnken效應面法近年來已廣泛應用于制劑的優化[17-18],適用于多因素多水平實驗設計,評價因素與指標間的非線性關系,具有預測性好、精度高的優點。現擬將單一藥物唑來膦酸用逆向蒸發法[19]制備成脂質體,并通過Box-Behnken效應面法對包封率、載藥量進行優化[20-21],驗證用最佳處方制備的唑來膦酸脂質體(zoledronic acid liposomes,ZOL-LIPs)在體液(pH7.4)中的穩定性,研究唑來膦酸脂質體對人乳腺癌MCF-7細胞的抑制作用,探索一種有效的乳腺癌治療方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

日立L-2000系列高效液相色譜儀、TGL-16C型臺式離心機均購自日本Hitachi公司;RE52CS型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);KYC-100B型恒溫培養搖床(上海福瑪實驗設備有限公司);馬爾文激光粒度儀(美國DT公司);TECAN SPECTRA多功能酶標儀(德國Wetzlar公司);細胞培養超凈工作臺(上海龍躍儀器設備制造有限公司);MM-1型微量振蕩器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試藥

唑來膦酸一水合物(質量分數98.0%,南京康滿林化工實業有限公司);蛋黃卵磷脂、膽固醇均購自上海艾韋特醫藥科技有限公司;甲基噻唑藍(methylthiazole blue,MTT)、胰酶、DMSO均購自美國Sigma公司;高糖DMEM培養基(美國HyClone公司);96孔細胞培養板(無錫耐思生物科技有限公司);乙腈(色譜純,山東禹王化工有限公司);磷酸(色譜純,天津市康科德科技有限公司);超濾離心管(默克密理博公司);Triton X-100(國藥集團化學試劑有限公司);透析袋(相對分子質量14 000,美國聯合碳化物公司);四丁基氫氧化銨(質量分數10%,天津市科密歐化學試劑有限公司);焦磷酸鈉(天津市永大化學試劑有限公司)。

1.3 細胞

人乳腺癌細胞株MCF-7購自北京北納創聯生物技術研究院。

2 方法與結果

2.1 唑來膦酸脂質體及空白脂質體的制備

2.1.1唑來膦酸脂質體(ZOL-LIPs)的制備 將適量磷脂、膽固醇置于圓底燒瓶中,用氯仿溶解,旋蒸除去氯仿形成一層薄膜,再用乙醚溶解,加入適量唑來膦酸的PBS水溶液,水浴超聲20 min,再旋蒸除去乙醚后,得到乳白色凝膠,加入適量PBS溶液,50 ℃孵育30 min,即得ZOL-LIPs混懸液。

2.1.2空白脂質體(BLANK-LIPs)的制備 制備方法同唑來膦酸脂質體,用適量PBS水溶液代替唑來膦酸的PBS水溶液即可。

2.2 唑來膦酸體外分析方法的建立

2.2.1色譜分析條件與標準曲線 色譜柱為Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-緩沖液(含質量濃度為177.68 mg·L-1的焦磷酸鈉、149.97 mL質量濃度為100.0 mg·L-1的四丁基氫氧化銨,調pH至6.9)=17∶83;流速為1 mL·min-1;檢測波長為209 nm;進樣量為20 μL。標準曲線為A=11 619C-41 294(R2=0.999 4),唑來膦酸質量濃度在5.00～100.00 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.2包封率測定 采用超濾離心法[22]測定唑來膦酸的包封率,精密量取ZOL-LIPs混懸液0.5 mL,置于10 mL量瓶中,加入適量質量濃度為100.0 mg·L-1的Triton X-100破乳,定容,按照2.2.1項下的條件進樣測定并記錄峰面積,計算總藥量W1;另取ZOL-LIPs混懸液0.5 mL置于超濾離心管中,以5 000 r·min-1離心30 min,測定并記錄峰面積,計算外管中游離藥物量W2。包封率(EE)=[(W1-W2)/W1]×100%。

2.3 Box-Behnken實驗設計

2.3.1因素和水平設計 包封率和載藥量是評價ZOL-LIPs質量的重要指標,選擇對脂質體包封率影響顯著的3個因素,即藥物與磷脂的質量比(A)、磷脂與膽固醇的質量比(B)、乙醚與PBS的體積比(C),各設計3個水平,以包封率(y1,EE)和載藥量(y2,DL)為評價指標,采用Box-Behnken實驗設計進行優化。因素水平見表1,設計與結果見表2。

表1 Box-Behnken實驗設計中的變量

2.3.2二次回歸模型的建立 利用Box-Behnken軟件對表2中的數據進行回歸分析,得到二次回歸模型:EE(%)=43.76-3.76A+1.54B-0.50C+1.10AB-0.73AC+0.38BC-10.36A2-6.86B2-3.33C2(R2=0.971 9);DL(%)=2.10+0.71A+0.41B-0.025C+0.27AB-0.050AC+0.050BC-0.54A2-0.49B2-0.26C2(R2=0.989 8)。回歸方程系數顯著性檢驗結果見表3。

表2 實驗設計及結果

2.3.3方差分析和顯著性檢驗 結果見表3。2個擬合方程的相關系數表明模型的擬合程度良好,由表3中的回歸系數顯著性檢驗P值可知,模型1中的A(P=0.000 9)]、A2(P<0.000 1)、B2(P=0.000 2)、C2(P=0.009 5)極顯著,其他項不顯著,且失擬差(Lack ofFit)(P=0.105 8)也不顯著;模型2中的A(P<0.000 1)、B(P<0.000 1)、AB(P=0.001 7)、A2(P<0.000 1)、B2(P<0.000 1)、C2(P=0.001 9)極顯著,其他項不顯著,且失擬差(Lack of Fit)(P=0.090 1)也不顯著。表明可利用該模型對ZOL-LIPs處方的包封率和載藥量進行分析和預測,且因素A的影響最大,其次依次為B、C。

表3 回歸方程中系數的顯著性檢驗

2.3.4效應面優化與驗證 應用Design Expert軟件,繪制各指標與3個自變量的三維曲面圖。結果見圖1和圖2。圖1和圖2可以直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響,并得到優化后的處方(A=0.067、B=5.503、C=1.941)。圖中響應面曲線和等高線說明響應值(包封率和載藥量)受到3個因素間交互作用的影響較顯著,這與方差分析的結果一致。

圖1 藥物與磷脂質量比(A)、磷脂與膽固醇質量比(B)、乙醚與PBS體積比(C)對包封率(y1)影響的效應面圖

圖2 藥物與磷脂質量比(A)、磷脂與膽固醇質量比(B)、乙醚與PBS體積比(C)對載藥量(y2)影響的效應面圖

按優化后的處方平行進行3次實驗,實驗觀察值與模型預測值接近,表明該模型可準確預測包封率、載藥量,其實驗值和預測值見表4。

表4 模型驗證實驗的預測值和實測值

2.3.5ZOL-LIPs表征 用激光粒度儀測定脂質體的粒徑、多分散性及Zeta電位,用透射電鏡觀察脂質體的微觀形態[23-24]。

取用最優處方制備的ZOL-LIPs混懸液適量,稀釋,用0.22 μm微孔濾膜過濾后,用馬爾文激光粒度儀對ZOL-LIPs混懸液的粒徑與Zeta電位平行測定3次,結果見圖3。由圖3可見,ZOL-LIPs的平均粒徑為(197.3±1.7) nm,PDI為(0.170±0.027),Zeta電位為(-21.4±0.34) mV。

注:A.ZOL-LIPs混懸液的粒徑分布;B.ZOL-LIPs混懸液的Zeta電位。

取ZOL-LIPs混懸液適量,取稀釋10倍的樣品10 μL滴在覆有支持膜的銅網上,靜置5 min后用濾紙吸干,再滴加適量質量濃度為10.0 mg·L-1的磷鎢酸溶液于銅網上染色5 min,置于透射電鏡下觀察,結果見圖4。由圖4可見,ZOL-LIPs呈球狀或類球狀,粒徑為170～220 nm。

圖4 ZOL-LIPs混懸液的透射電鏡圖

2.3.6穩定性考察 通過測定脂質體在4 ℃存放時的滲漏率來評價脂質體的穩定性[25]。取ZOL-LIPs混懸液適量,測定其在4 ℃存放1、2、3、5、7、10、15 d的滲漏率(LR%),結果見圖5。由圖5可見,ZOL-LIPs在15 d內,包載的唑來膦酸的滲漏率在15%以下,符合穩定性要求。

圖5 ZOL-LIPs混懸液在4 ℃放置15 d的滲漏率曲線 (n=3)

2.3.7體外釋放研究 利用透析法[26-27]研究ZOL水溶液與ZOL-LIPs混懸液的體外釋放行為。分別精密量取ZOL水溶液與ZOL-LIPs混懸液置于透析袋中,置于裝有PBS緩沖液的50 mL錐形瓶中,37 ℃下恒溫振蕩。分別于0.5、l、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h吸取1 mL釋放介質,同時補加等體積空白介質,測定ZOL的釋放量,ZOL的累積釋放度見圖6。由圖6可見,ZOL-LIPs混懸液中ZOL的釋放速度比ZOL水溶液中的ZOL釋放速度更慢,表明脂質體具有一定的緩釋作用,且ZOL-LIPS中的ZOL在48 h內的釋放量能達到80%以上。

圖6 ZOL-LIPs混懸液和ZOL水溶液的體外釋放曲線 (n=3)

2.3.8體外細胞毒性評價 用MTT測定法評估ZOL原料藥、BLANK-LIPs及ZOL-LIPs的體外細胞毒性[28]。分別用無血清高糖DMEM培養液稀釋ZOL水溶液、BLANK-LIPs混懸液和ZOL-LIPs混懸液,配制成質量濃度分別為1.45、2.90、5.80、8.70、14.50、29.00、58.00、145.00 μg·mL-1的系列ZOL水溶液及ZOL-LIPs混懸液。將MCF-7細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中,在體積分數5% CO2、37 ℃培養12 h,于每孔中加入200 μL各系列質量濃度的ZOL水溶液、BLANK-LIPs及ZOL-LIPs,各質量濃度設置3個復孔,繼續培養48 h,加入20 μL MTT溶液,培養4 h,棄去混合溶液,各孔中加入150 μL DMSO溶液溶解,在微量振蕩器上振蕩10 min使結晶紫充分溶解,測定490 nm處的吸光度值,計算細胞存活率和IC50值,結果見圖7。

由圖7可見,ZOL水溶液、BLANK-LIPs對MCF-7細胞的抑制作用較小,而ZOL-LIPs對MCF-7細胞具有一定的抑制作用,其IC50值為110.55 μg·mL-1。

圖7 不同質量濃度的ZOL水溶液、BLANK-LIPs和ZOL-LIPs混懸液對MCF-7細胞的毒性 (n=3)

3 討論

研究發現,影響ZOL-LIPs包封率最主要的因素為藥物與磷脂的質量比(P=0.000 9),呈負相關。分析是由于磷脂質量相對于藥物增加時,形成的脂質體數量增多,且粒徑增大,包封于脂質體中的內水相體積增大,能包載更多藥物,因而包封率提高。當藥物量相同時,若磷脂量過多,形成的ZOL-LIPs容易聚集融合,導致藥物泄漏;若磷脂量過少,形成的ZOL-LIPs的數量減少,內水相的體積減小,則包封率隨之降低。

影響ZOL-LIPs載藥量最主要的因素為藥物與磷脂的質量比(P<0.000 1)和磷脂與膽固醇的質量比(P<0.000 1),載藥量隨著藥物與磷脂質量比的增大而先增大后減小,分析是由于當藥物與磷脂質量比值較小(藥物相對含量低)時,磷脂可以全部將藥物包裹于內水相,載藥量隨著藥物量的增加而增大,但當藥物與磷脂質量比值較大(磷脂相對含量低)時,則無法將全部藥物包裹于脂膜中,導致載藥量下降。

本實驗采用逆向蒸發法制備ZOL-LIPs,通過Box-Behnken響應面法優化得到ZOL-LIPs的最優處方:藥物與磷脂的質量比為0.067,磷脂與膽固醇的質量比為5.503,乙醚與PBS的體積比為1.941。制得的ZOL-LIPs包封率和載藥量分別為43.152%和2.257%,與預測值偏差較小,表明Box-Behnken響應面法實驗設計科學、合理。

制得的ZOL-LIPs粒徑為(197.3±1.7) nm,分布均勻,可減少唑來膦酸在骨骼中的蓄積,使其靶向至腫瘤部位。此外,唑來膦酸包封率和載藥量的提高不但可以降低治療時的給藥劑量,而且其在體液pH條件下泄露量少、穩定性好,能有效降低腎毒性。ZOL-LIPs對乳腺癌細胞的抑制作用明顯優于ZOL水溶液和空白脂質體。因此,包封率高、粒徑小的ZOL-LIPs可為乳腺癌及晚期乳腺癌骨轉移的治療提供新的方法。