羅氟司特對大鼠創傷性腦損傷的作用及其機制研究

石昆林，李晨希，宗建春

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是40歲以下人群致死、致殘的常見原因。截至2017 年底，我國TBI 患者的絕對人數已超過了世界上大多數國家，造成了巨大的社會負擔［1］。有研究表明，創傷后炎癥反應在TBI 的病理過程中有著重要的作用［2］。羅氟司特（Roflumilast，RF）是一種選擇性磷酸二酯酶4 抑制劑，可提高環磷酸腺苷（cAMP）水平。Keskin 等［3］在腦缺血再灌注損傷的研究中發現，RF具有抑制炎癥反應，減輕腦細胞損傷的作用，且可能與NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）有關，但其能否減輕TBI仍未可知。本研究建立TBI 大鼠模型后，腹腔注射RF 溶液，通過觀察TBI 后傷側大腦皮層內白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、NLRP3、神經元病理特點和大鼠神經功能缺損評分的變化，探究RF 對大鼠TBI的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性Sprague-Dawley 大鼠36只，8周齡，體質量220~250 g，購自重慶醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號：SCXK（渝）2022-0010。動物飼養于重慶醫科大學動物實驗中心動物房。實驗大鼠的模型操作及取材過程取得重慶醫科大學附屬第二醫院實驗動物倫理委員會許可。

1.1.2 主要試劑與儀器 RF粉劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；IL-6、IL-1β 和TNF-α 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒均購自廈門侖昌碩生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）高清恒染試劑盒、兔源抗NLRP3 一抗、山羊抗兔二抗（IgG）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司；低溫離心機購自德國Eppendorf公司；顯微鏡購自日本NIKON公司。

1.2 方法

1.2.1 TBI模型的建立及分組 36只大鼠按隨機數字表法分為3 組：假手術（Sham）組、TBI 組、TBI+RF 組，每組12 只。Sham 組大鼠無撞擊過程，其余過程與其他2 組相同。TBI+RF組和TBI組大鼠均采用改良Feeney自由落體法［4］建立TBI模型。具體步驟：（1）用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射將大鼠麻醉，并固定于立體定位架，去除耳后與雙眼之間的毛發，保證術區視野清潔。（2）做頂部正中線右側切口，逐層分離組織，充分暴露顱骨，在矢狀縫右側和冠狀縫后方約3 mm 處鉆直徑約5 mm骨窗，確保硬腦膜完整。（3）將骨窗與自由落體打擊裝置連接妥當，10 g 重錘從20 cm 高處沿管道自由下落沖擊撞桿，造成大腦頂葉挫裂傷。（4）止血、消毒后縫合頭皮。

1.2.2 干預方法及樣本采集 TBI+RF 組大鼠建模后即刻、1 d、2 d 腹腔注射RF（1 mg/kg）溶液，TBI 組和Sham 組注射等量溶劑（5%DMSO 和95%生理鹽水溶液）。建模后3 d 時，按隨機數字表法抽取各組大鼠：4 只大鼠用生理鹽水和4%多聚甲醛進行心臟灌注，取出全腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，制成厚度為4μm的切片，用于HE染色和NLRP3免疫組化染色；4只大鼠處死后，立即取出全腦，置于液氮中速凍，再轉移至-80 ℃冰箱中保存，用于ELISA檢測。

1.2.3 大鼠神經功能缺損評分 在建模后1、2、3、7 和14 d時，采用改良神經功能缺損嚴重程度評分（modified neurological severity score，mNSS）量表評估大鼠神經功能［5］。該量表包括運動（肌肉狀態和異常運動）、感覺（視覺、觸覺和本體感受）、反射反應和平衡測試。若小鼠無法進行測試或缺乏預期的反應，則獲得1分。1~6分為輕度功能缺損，7~12分為中度功能缺損，13~18分為重度功能缺損。

1.2.4 HE染色觀察病灶周圍皮層大鼠神經元病理變化 取1.2.2 制作的石蠟切片，烤片、脫蠟、水化后，進行標準HE 染色，中性樹脂封固，在光學顯微鏡下觀察并拍照。每只大鼠選擇3張切片，每張切片在病灶周圍讀取5個不同視野，由對實驗分組不知情的研究人員使用Image J 分析死亡神經元數量，結果以死亡神經元的百分比表示［6］。

1.2.5 ELISA 檢測IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量 處死大鼠后立即取出腦組織，在冰面上分離傷側頂葉皮層組織，制成組織勻漿，離心（5 000 r/min，10 min，4 ℃）后取上清液，參照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 NLRP3 免疫組化染色分析 取1.2.2 制作的石蠟切片經烤片、脫蠟、水化后，PBS洗滌3次，每次5 min；用檸檬酸抗原修復緩沖液進行抗原修復，PBS 洗滌3 次，每次5 min。滴加3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加3%牛血清白蛋白室溫孵育30 min，進行血清封閉。切片滴加NLRP3 一抗（稀釋度1∶200）置于濕盒內4 ℃孵育過夜。次日PBS 洗滌3 次，每次5 min。滴加辣根過氧化物酶標記的IgG二抗（稀釋度1∶200）室溫下孵育50 min。滴加二氨基聯苯胺顯色液顯色，PBS 洗滌3 次，每次5 min，用蘇木素復染約3 min 后封片，置于顯微鏡下觀察、拍照。每只大鼠選擇3張切片，每張切片在病灶周圍讀取5個不同視野，由對實驗分組不知情的研究人員使用Image J 軟件分析NLRP3 含量，結果以平均光密度（AOD）值表示。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠mNSS比較 各組大鼠在建模后1、2、3、7、14 d 的mNSS 比較差異有統計學意義（均P＜0.05）。與Sham 組比較，TBI 組與TBI+RF 組大鼠各時間點mNSS 均升高（均P＜0.05）；建模后1、2、3 d內，TBI 組與TBI+RF 組大鼠mNSS 差異無統計學意義，建模后7、14 d時，TBI+RF組大鼠mNSS較TBI組降低（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of mNSS at different time points after modeling between the three groups表1 各組大鼠建模后不同時間點mNSS比較（n=4，分，±s）

Tab.1 Comparison of mNSS at different time points after modeling between the three groups表1 各組大鼠建模后不同時間點mNSS比較（n=4，分，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05。

組別Sham組TBI組TBI+RF組F建模后時間（d）1 1.50±0.58 13.75±0.96a 14.00±0.82a 319.696＊＊2 1.00±0.82 13.50±1.00a 13.75±0.50a 332.739＊＊3 1.25±0.50 12.75±1.50a 12.50±0.58a 182.735＊＊7 1.00±0.82 11.50±0.58a 10.00±0.82ab 232.200＊＊14 1.00±0.82 9.25±0.96a 7.25±0.96ab 88.900＊＊

2.2 各組大鼠損傷側皮層中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較 ELISA結果顯示，與Sham組比較，TBI組和TBI+RF組大鼠損傷側皮層中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高（P＜0.05）；與TBI 組比較，TBI+RF 組大鼠損傷側皮層中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the injured cortex of rats between the three groups表2 各組大鼠損傷側皮層IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（n=4，ng/g，±s）

Tab.2 Comparison of contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the injured cortex of rats between the three groups表2 各組大鼠損傷側皮層IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（n=4，ng/g，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05。

組別Sham組TBI組TBI+RF組F IL-1β 0.138±0.006 0.174±0.013a 0.158±0.004ab 19.081＊＊IL-6 0.329±0.031 0.506±0.037a 0.443±0.024ab 33.698＊＊TNF-α 1.008±0.031 1.444±0.127a 1.286±0.044ab 30.813＊＊

2.3 各組大鼠病灶周圍皮層神經元病理變化及死亡神經元數量比較 Sham組神經元排列規則，大多形態正常，細胞核大而圓，呈空泡狀，核仁明顯，周圍腦組織細胞間質無明顯水腫。TBI 組和TBI+RF 組病灶周圍腦組織結構疏松，細胞間質水腫明顯，見較多死亡神經元，胞體縮小、變形，細胞核固縮、裂解，胞漿呈淡紅色，見圖1。與Sham組比較，TBI組大鼠病灶周圍皮層中死亡神經元比例升高（P＜0.05）；與TBI 組比較，TBI+RF 組大鼠病灶周圍皮層中死亡神經元百分比降低（P＜0.05），見表3。

2.4 各組大鼠病灶周圍NLRP3含量比較 3組大鼠腦組織病灶周圍均可見不同數量的NLRP3 陽性細胞，見圖2。與Sham 組比較，TBI 組大鼠病灶周圍NLRP3 含量升高（P＜0.05）；與TBI 組比較，TBI+RF組大鼠病灶周圍NLRP3 含 量 降 低（P＜0.05），見表3。

Fig.1 Comparison of pathological changes of neurons in perifocal cortex of rats between the three groups(HE staining)圖1 各組大鼠病灶周圍神經元病理變化比較（HE染色）

Tab.3 Comparison of the number of dead neurons and NLRP3 content in the perifocal cortex of rats between the three groups表3 各組大鼠病灶周圍皮層中死亡神經元數量和NLRP3含量的比較 （n=4，±s）

Tab.3 Comparison of the number of dead neurons and NLRP3 content in the perifocal cortex of rats between the three groups表3 各組大鼠病灶周圍皮層中死亡神經元數量和NLRP3含量的比較 （n=4，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與TBI組比較，P＜0.05。

組別Sham組TBI組TBI+RF組F死亡神經元（%）23.430±0.933 51.213±1.590a 37.198±1.528b 403.925＊＊NLRP3陽性表達AOD值0.035±0.002 0.055±0.002a 0.039±0.04b 57.907＊＊

Fig.2 Comparison of NLRP3 content around lesion between the three groups(Immunohistochemical staining)圖2 各組大鼠病灶周圍NLRP3含量比較（免疫組化染色）

3 討論

TBI 是在外力作用下對大腦造成的一種獲得性損害。目前仍缺乏針對TBI 的有效藥物療法，臨床多以對癥治療和長期康復訓練為主，以此來促進傷后神經功能的恢復［7-8］。RF 吸收入血后，在體內迅速代謝為RF氮氧化物，可以很容易地穿過血腦屏障滲透到大腦［9］，間接提高腦組織內cAMP 含量，已被證明對海馬神經元損傷和腦缺血模型動物具有神經保護作用［3，10-11］。另外，Blokland 等［12］發現RF 可以改善健康老年人的言語記憶成績。本研究探討了RF 對大鼠TBI 的影響，發現經RF 治療后7 d、14 d mNSS 低于TBI 組；同時，其病灶周圍大腦皮層細胞間質水腫減輕，死亡神經元減少，提示RF 治療可以減輕大鼠TBI，具有神經保護作用，但其作用機制仍未完全明確。

神經炎癥貫穿于TBI 急性和慢性階段，可修復受損的組織，但過度產生的促炎癥介質卻成為TBI病理進展的重要推動力。TBI 后早期神經炎癥包括神經膠質細胞（小膠質細胞和星形膠質細胞）激活和腦內大量炎癥介質釋放，如NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β等［13］。NLRP3是第一個在大腦中被研究的炎癥小體，主要位于小膠質細胞中，其激活可以誘導趨化因子和IL-1β、IL-18、胱天蛋白酶-1 等炎癥介質的釋放［14］，是TBI 后神經炎癥和神經行為障礙的主要驅動因素之一。有研究表明，通過抑制NLRP3可以減輕腦水腫，縮小病灶體積，改善長期運動和認知功能，從而改變TBI模型小鼠預后［15］。Wang等［16］也發現抑制IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性因子可以緩解TBI后神經炎癥損傷。在本研究中，與Sham組比較，TBI 組大鼠病灶周圍皮層中IL-1β、IL-6、TNF-α 和NLRP3 含量均升高，表明TBI 后早期神經炎癥已激活，而經RF治療后，上述炎癥介質含量均明顯降低，提示RF對大鼠TBI的神經保護作用可能與抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和NLRP3等促炎介質相關。

cAMP 是TBI 的一個關鍵因素，在神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞內發揮信號級聯作用。有研究發現，在大鼠TBI 早期，腦組織內cAMP 含量即出現明顯下降［17］，這種下降持續到傷后14 d 仍可被檢測到［18］，而提高cAMP含量可以提高TBI模型小鼠的學習記憶成績［19］。另一項研究發現，抑制磷酸二酯酶10A 可以縮短大鼠在TBI 后尋找平臺的時間，減輕TBI所致的神經元損傷，具有神經保護作用，這與cAMP/蛋白激酶A（PKA）信號通路的激活密切相關［20］。cAMP/PKA 信 號 通 路 被 激 活 后，可 導 致NLRP3 表達下調，而應用PKA 抑制劑，則可逆轉這種現象。此外，cAMP/PKA 信號通路激活也下調了TBI 后腦組織內TNF-α、IL-6、IL-1β 等促炎因子水平。本研究應用RF間接提高TBI后腦組織內cAMP含量，結果發現NLRP3、TNF-α、IL-6、IL-1β 含量降低，與上述研究結果一致，提示RF 抑制TBI 后早期神經炎癥可能與激活cAMP/PKA 信號通路有一定關系。

綜上所述，RF 通過降低TBI 早期炎癥介質水平，減輕大鼠創傷性腦損傷，起到神經保護作用，與激活cAMP/PKA信號通路有一定關系。但本研究中未檢測cAMP 和PKA 相關蛋白含量，未來仍需更多的研究探討RF 調控cAMP/PKA 信號通路的作用機制。