沉默Salusin-β對(duì)糖尿病大鼠內(nèi)皮功能障礙的影響及機(jī)制研究

左憲宏，張婷婷△，李月琴，趙佳琪

糖尿病（DM）是一種常見(jiàn)的慢性疾病，其特征是高血糖和內(nèi)皮功能受損［1］。內(nèi)皮功能障礙是DM 心血管并發(fā)癥發(fā)病的關(guān)鍵和起始因素［2-3］。因此，了解DM引起的內(nèi)皮功能障礙發(fā)生機(jī)制，改善或增強(qiáng)內(nèi)皮功能對(duì)于預(yù)防DM心血管并發(fā)癥有重要意義。心血管調(diào)節(jié)肽（Salusin-β）是一種內(nèi)源性生物活性肽。研究顯示，DM患者血清中Salusin-β水平升高，且與其心血管病變有關(guān)［4］。Salusin-β可加速血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并增加血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速高葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［5-6］。Salusin-β沉默可提高DM 主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮功能障礙［7］。然而，Salusin-β在DM中的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討Salusin-β在DM大鼠內(nèi)皮功能障礙中的作用及其潛在的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級(jí)8 周齡雄性SD 大鼠52 只，體質(zhì)量208~240 g，由河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2020-0009，在標(biāo)準(zhǔn)化條件下飼養(yǎng)。鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；編碼Salusin-β短發(fā)夾RNA（shRNA）的腺病毒載體（Ad-Salusin-β shRNA）及其陰性對(duì)照腺病毒空載體（Ad-scramble shRNA）由上海吉滿生物科技有限公司構(gòu)建；大鼠Salusin-β、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；二氫乙錠（DHE）超氧化物陰離子熒光探針、PCR試劑盒購(gòu)自上海懋康生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；兔源還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）、核因子κB p65（NF-κB p65）、核纖層蛋白B1（Lamin B1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗以及羊抗兔二抗購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司。Accu-Chek Active 型血糖儀、iMark680 型酶標(biāo)儀、DMT 620M 型離體微血管張力測(cè)定儀購(gòu)自上海怡耀科學(xué)儀器有限公司；DM2500 型熒光顯微鏡、7500 型熒光定量PCR（RT-qPCR）儀、Omega Fluor 型凝膠成像儀購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 DM模型制備及分組干預(yù) 將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照（NC）組12只和造模組40只。造模組大鼠使用高糖高脂飼料（熟豬油15%、蔗糖20%、基礎(chǔ)飼料65%）適應(yīng)性喂養(yǎng)1 個(gè)月后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ（60 mg/kg）構(gòu)建DM 模型［8］；NC 組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，并在禁食12 h 后腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ 后3 d 使用血糖儀測(cè)定空腹血糖（FBG）水平，選擇連續(xù)3 d FBG≥16.7 mmol/L的36只大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（其余4只大鼠FBG水平不符合造模成功條件）。造模成功1周后，將36只DM大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為DM組、Ad-Scr shRNA組和Ad-Salusin-β shRNA 組，每組12只；Ad-Scr shRNA 組大鼠尾靜脈注射Adscramble shRNA，Ad-Salusin-β shRNA 組大鼠尾靜脈注射Ad-Salusin-β shRNA，劑量均為2.0×1010pfu/mL，NC 組和DM組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。2周后重復(fù)注射1次，第2次注射后2周進(jìn)行取材和相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。本研究經(jīng)張家口學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（ZJKXY-2021LS-109）。

1.2.2 大鼠FBG 和血清Salusin-β 水平檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后，禁食12 h，尾部采血1 mL，血糖儀檢測(cè)大鼠FBG水平。用5%的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血3 mL，4 ℃、3 000 r/min離心10 min分離血清，ELISA檢測(cè)血清Salusin-β水平。

1.2.3 大鼠胸主動(dòng)脈血管舒張功能檢測(cè) 給藥結(jié)束后，頸椎脫臼法處死大鼠，分離其胸主動(dòng)脈，從每個(gè)主動(dòng)脈切下2個(gè)長(zhǎng)度為2~3 mm 的血管環(huán)，放入含氧和預(yù)冷的Krebs-Henseleit溶液的培養(yǎng)皿中。使用離體微血管張力測(cè)定儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，動(dòng)脈環(huán)在最佳初始張力下平衡1 h，去氧腎上腺素（1μmol/L）收縮主動(dòng)脈環(huán)，添加內(nèi)皮依賴性血管舒張激活劑乙酰膽堿（Ach，濃度依次為1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5及1×10-4mol/L）或內(nèi)皮非依賴性血管舒張激活劑硝普鈉（SNP，濃度依次為1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）刺激主動(dòng)脈環(huán)舒張，主動(dòng)脈舒張功能以Ach或SNP引起的血管舒張張力占去氧腎上腺素引起的血管收縮張力的百分比表示。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA 及SOD 水平 取大鼠部分胸主動(dòng)脈，加9 倍質(zhì)量的生理鹽水研磨制備10%的組織勻漿，然后4 ℃、5 200 r/min離心5 min，取上清液，參照試劑盒說(shuō)明書，ELISA法檢測(cè)胸主動(dòng)脈勻漿中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD水平。

1.2.5 DHE 染色檢測(cè)胸主動(dòng)脈中活性氧（ROS）水平 取大鼠部分胸主動(dòng)脈，包埋在最佳切割溫度化合物中，將組織切成25μm 厚的切片，與DHE（10μmol/L）一起在37 ℃下避光孵育5 min，DHE在與超氧化物反應(yīng)后被氧化成溴化乙錠，后者與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合。在熒光顯微鏡下觀察熒光，并用Image J軟件分析相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.2.6 HE染色觀察大鼠胸主動(dòng)脈組織病理學(xué)變化 將大鼠部分胸主動(dòng)脈組織用4%多聚甲醛固定、脫水并包埋在石蠟中。石蠟包埋切片（厚度5μm）經(jīng)烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木精染色5 min，伊紅染色2 min。在光學(xué)顯微鏡下觀察，并用Image J軟件定量評(píng)估胸主動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度。

1.2.7 RT-qPCR 檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈Salusin-β 和NOX2 mRNA水平 大鼠胸主動(dòng)脈總RNA用TRIzol試劑分離，通過(guò)分光光度計(jì)來(lái)評(píng)估RNA 濃度和純度，然后將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將所得cDNA 用作qPCR 模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。內(nèi)參為GAPDH，引物序列見(jiàn)表1。2-ΔΔCt法計(jì)算Salusin-β和NOX2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.2.8 Western blot 法檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈NOX2、NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取部分大鼠胸主動(dòng)脈，液氮中充分研磨，采用細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取蛋白。4 ℃，12 000×g離心5 min 收集上清液，并使用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)電泳分離等量的蛋白質(zhì)（20μg）并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%牛血清白蛋白封閉2 h 后，將膜與一抗NOX2（1∶500）、NF-κB p65（1∶500）、Lamin B1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃下孵育過(guò)夜。將膜與羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h，使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑可視化蛋白質(zhì)條帶，細(xì)胞核NF-κB p65 以Lamin B1 為內(nèi)參蛋白，NOX2 和細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65 以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG 和血清Salusin-β 水平比較 與NC組比較，DM組大鼠FBG和血清Salusin-β水平升高（P＜0.05）。DM 組和Ad-Scr shRNA 組大鼠FBG和血清Salusin-β 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與DM 組 和Ad-Scr shRNA 組 比 較，Ad-Salusin-β shRNA 組大鼠FBG 和血清Salusin-β 水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.2 各組大鼠胸主動(dòng)脈血管舒張功能比較 與NC組比較，DM 組大鼠在不同濃度Ach（1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L）誘發(fā)條件下的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能降低（P＜0.05）。DM 組和Ad-Scr shRNA組大鼠不同濃度Ach（1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L）誘發(fā)條件下的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DM 組和Ad-Scr shRNA 組比較，Ad-Salusin-β shRNA 組大鼠在不同濃度Ach（1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L）誘發(fā)條件下的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能升高（P＜0.05）；而SNP干預(yù)后4組大鼠內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3、4。

Tab.2 Comparison of FBG and serum Salusin-β levels between the four groups of rats表2 各組大鼠FBG和血清Salusin-β水平比較（n=12，±s）

Tab.2 Comparison of FBG and serum Salusin-β levels between the four groups of rats表2 各組大鼠FBG和血清Salusin-β水平比較（n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與DM組比較，c與Ad-Scr shRNA組比較，P＜0.05。

組別NC組DM組Ad-Scr shRNA組Ad-Salusin-β shRNA組F FBG（mmol/L）5.74±1.08 26.03±3.15a 27.85±3.24a 15.29±2.36abc 186.794＊＊Salusin-β（μg/L）0.62±0.11 1.35±0.20a 1.44±0.18a 0.73±0.12bc 85.501＊＊

Tab.3 Comparison of endothelium-dependent vasodilation function induced by Ach between the four groups of rats表3 各組大鼠Ach誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能比較 （n=12，%，±s）

Tab.3 Comparison of endothelium-dependent vasodilation function induced by Ach between the four groups of rats表3 各組大鼠Ach誘發(fā)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能比較 （n=12，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與DM組比較，c與Ad-Scr shRNA組比較，P＜0.05。

組別NC組DM組Ad-Scr shRNA組Ad-Salusin-β shRNA組F Ach濃度1×10-8 mol/L 5.15±0.60 5.09±0.55 5.11±0.57 5.14±0.52 0.029 1×10-7 mol/L 24.38±2.59 12.57±2.06a 11.48±2.15 19.25±2.32bc 83.675＊＊1×10-6 mol/L 61.42±7.30 40.29±5.42a 37.68±6.04 51.33±7.15bc 33.542＊＊1×10-5 mol/L 85.09±9.62 53.18±7.15a 51.36±6.90 68.45±8.74bc 44.256＊＊1×10-4 mol/L 90.41±9.75 57.62±8.31a 54.53±7.42 73.86±9.50bc 42.445＊＊

Tab.4 Comparison of endothelium independent vasodilation function induced by SNP between the four groups of rats表4 各組大鼠SNP誘發(fā)的內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能比較 （n=12，%，±s）

Tab.4 Comparison of endothelium independent vasodilation function induced by SNP between the four groups of rats表4 各組大鼠SNP誘發(fā)的內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能比較 （n=12，%，±s）

均P＞0.05。

組別NC組DM組Ad-Scr shRNA組Ad-Salusin-β shRNA組F SNP濃度1×10-9 mol/L 10.20±1.14 10.15±1.29 9.87±1.05 10.13±1.21 0.190 1×10-8 mol/L 24.16±2.74 21.82±2.53 22.30±2.46 24.11±2.80 2.545 1×10-7 mol/L 64.48±8.20 59.31±7.45 60.27±8.16 62.54±7.93 1.027 1×10-6 mol/L 87.50±10.31 82.36±9.24 84.02±11.37 85.75±9.68 0.568 1×10-5 mol/L 94.25±12.18 89.82±10.56 91.40±10.29 93.37±11.44 0.383

Tab.5 Comparison of TNF-α,IL-6,IL-1β,MDA and SOD levels in thoracic aorta tissue between the four groups of rats表5 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD水平比較 （n=12，±s）

Tab.5 Comparison of TNF-α,IL-6,IL-1β,MDA and SOD levels in thoracic aorta tissue between the four groups of rats表5 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與DM組比較，c與Ad-Scr shRNA組比較，P＜0.05。

組別NC組DM組Ad-Scr shRNA組Ad-Salusin-β shRNA組F TNF-α（ng/g）82.45±11.03 275.26±32.58a 280.31±35.27 143.19±24.65bc 153.271＊＊IL-6（ng/g）34.76±5.62 156.35±20.13a 164.49±21.58 82.51±14.07bc 167.687＊＊IL-1β（ng/g）15.22±2.41 61.68±7.53a 63.19±6.82 34.04±5.39bc 186.272＊＊MDA（μmol/g）3.24±0.50 9.57±0.76a 9.63±0.81 5.80±0.64bc 245.793＊＊SOD（kU/g）54.06±6.39 21.83±3.65a 22.12±4.08 40.35±5.54bc 115.173＊＊

2.3 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD 水平比較 與NC 組比較，DM 組大鼠胸主動(dòng)脈組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA 水平升高，SOD 水平降低（P＜0.05）；DM 組和Ad-Scr shRNA 組大鼠胸主動(dòng)脈組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DM 組和Ad-Scr shRNA組比較，Ad-Salusin-β shRNA組大鼠胸主動(dòng)脈組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA 水平降低，SOD水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表5。

2.4 各組大鼠胸主動(dòng)脈ROS水平比較 與NC組比較，DM 組大鼠胸主動(dòng)脈ROS 水平升高（P＜0.05）；DM組和Ad-Scr shRNA組大鼠胸主動(dòng)脈ROS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DM 組和Ad-Scr shRNA 組比較，Ad-Salusin-β shRNA 組大鼠胸主動(dòng)脈ROS水平降低（P＜0.05）；見(jiàn)圖1、表6。

2.5 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理學(xué)變化 NC 組大鼠的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮光滑、結(jié)構(gòu)完整，DM組和Ad-Scr shRNA組血管壁上的內(nèi)皮細(xì)胞脫落，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度較NC 組增加（P＜0.05）；與DM 組和Ad-Scr shRNA組比較，Ad-Salusin-β shRNA組大鼠內(nèi)皮相對(duì)光滑完整，主動(dòng)脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的損傷減輕，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度變薄（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表6。

Fig.1 ROS levels in thoracic aorta of rats in each group(DHE fluorescence method,×200)圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈ROS水平（DHE熒光法，×200）

Fig.2 HE staining of thoracic aorta tissue of rats in each group(×200)圖2 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織HE染色圖（×200）

2.6 各組大鼠胸主動(dòng)脈Salusin-β 和NOX2 mRNA水平比較 與NC 組比較，DM 組大鼠胸主動(dòng)脈Salusin-β 和NOX2 mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；DM 組和Ad-Scr shRNA 組大鼠胸主動(dòng)脈Salusin-β和NOX2 mRNA 表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DM 組 和Ad-Scr shRNA 組 比 較，Ad-Salusin-β shRNA 組 大 鼠 胸 主 動(dòng) 脈Salusin-β 和NOX2 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表7。

2.7 各組大鼠胸主動(dòng)脈NOX2和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較 與NC 組比較，DM 組大鼠胸主動(dòng)脈NOX2和細(xì)胞核NF-κB p65蛋表達(dá)白水平升高，細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；DM 組和Ad-Scr shRNA 組大鼠胸主動(dòng)脈NOX2、細(xì)胞核NF-κB p65、細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DM組和Ad-Scr shRNA組比較，Ad-Salusin-β shRNA 組大鼠胸主動(dòng)脈NOX2和細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表8。

Tab.6 Comparison of ROS levels and intima-media thickness of thoracic aorta between the four groups of rats表6 各組大鼠胸主動(dòng)脈ROS水平和內(nèi)膜-中膜厚度比較（n=12，±s）

Tab.6 Comparison of ROS levels and intima-media thickness of thoracic aorta between the four groups of rats表6 各組大鼠胸主動(dòng)脈ROS水平和內(nèi)膜-中膜厚度比較（n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與DM組比較，c與Ad-Scr shRNA組比較，P＜0.05。

組別NC組DM組Ad-Scr shRNA組Ad-Salusin-β shRNA組F ROS 1.00±0.00 3.58±0.37a 3.64±0.42 1.76±0.23bc 229.973＊＊胸主動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度（μm）45.18±5.26 82.37±9.41a 84.20±9.33 63.56±7.68bc 61.418＊＊

Tab.7 Comparison of Salusin-β and NOX2 mRNA levels in thoracic aorta of rats between the four groups表7 各組大鼠胸主動(dòng)脈Salusin-β和NOX2 mRNA水平比較 （n=12，±s）

Tab.7 Comparison of Salusin-β and NOX2 mRNA levels in thoracic aorta of rats between the four groups表7 各組大鼠胸主動(dòng)脈Salusin-β和NOX2 mRNA水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與DM組比較，c與Ad-Scr shRNA組比較，P＜0.05。

組別NC組DM組Ad-Scr shRNA組Ad-Salusin-β shRNA組F Salusin-β mRNA 1.00±0.00 2.58±0.31a 2.63±0.35 1.41±0.22bc 122.565＊＊NOX2 mRNA 1.00±0.00 2.12±0.23a 2.17±0.28 1.56±0.20bc 84.649＊＊

Fig.3 Western blot assay of NOX2,nuclear NF-κB p65 and cytoplasmic NF-κB p65 in thoracic aorta of rats in each group圖3 各組大鼠胸主動(dòng)脈NOX2、細(xì)胞核NF-κB p65、細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白印跡圖

Tab.8 Comparison of NOX2,nuclear NF-κB p65 and cytoplasmic NF-κB p65 protein levels in thoracic aorta of rats between the four groups表8 各組大鼠胸主動(dòng)脈NOX2、細(xì)胞核NF-κB p65、細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白水平比較 （n=12，±s）

Tab.8 Comparison of NOX2,nuclear NF-κB p65 and cytoplasmic NF-κB p65 protein levels in thoracic aorta of rats between the four groups表8 各組大鼠胸主動(dòng)脈NOX2、細(xì)胞核NF-κB p65、細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65蛋白水平比較 （n=12，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與DM組比較，c與Ad-Scr shRNA組比較，P＜0.05。

組別NC組DM組Ad-Scr shRNA組Ad-Salusin-β shRNA組F NOX2/GAPDH 0.34±0.05 0.82±0.09a 0.85±0.07 0.49±0.06bc 157.571＊＊細(xì)胞核NF-κB p65/Lamin B1 0.45±0.07 0.90±0.10a 0.92±0.11 0.63±0.08bc 73.437＊＊細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65/GAPDH 0.86±0.09 0.41±0.05a 0.39±0.06 0.72±0.08bc 125.903＊＊

3 討論

慢性并發(fā)癥是DM 死亡和致殘的主要原因，DM大血管病變是其主要并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者生命健康。內(nèi)皮功能障礙是大多數(shù)心血管疾病預(yù)后不良的早期獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，也是DM 相關(guān)的心血管疾病初始病理改變之一［9-10］。因此，改善內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是DM治療的有效策略之一。

Salusin-β是重要的血管活性肽，是心肌細(xì)胞［6］、血管平滑肌細(xì)胞［11］、內(nèi)皮細(xì)胞［7］和腎細(xì)胞［12］中的潛在促氧化劑，與高血壓［13］、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化［14］等心血管疾病關(guān)系密切。DM患者血清Salusin-β水平升高［4］，并且在DM 大鼠的心肌中也可見(jiàn)Salusin-β表達(dá)上調(diào)［6］。此外，在DM 腎損傷中，高糖以劑量和時(shí)間依賴性上調(diào)Salusin-β蛋白表達(dá)，引發(fā)腎小管細(xì)胞損傷［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，STZ 聯(lián)合高糖高脂飲食誘導(dǎo)的DM 大鼠血清Salusin-β 和胸主動(dòng)脈中Salusinβ mRNA 水平均增加，這與既往的研究結(jié)果一致［13-14］，表明高血糖可促進(jìn)Salusin-β 高表達(dá)。此外，在本研究中，Salusin-β 的過(guò)度表達(dá)伴隨著胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS 和NOX2 生成以及內(nèi)皮依賴性血管舒張障礙，而沉默Salusin-β 的表達(dá)通過(guò)抑制胸主動(dòng)脈中NOX2和ROS上調(diào)，改善了DM大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的內(nèi)皮依賴性血管舒張，阻止了DM 介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷。這與Salusin-β的促氧化活性一致［7］，提示Salusin-β可能在DM 的內(nèi)皮功能中起作用，Salusin-β 沉默對(duì)DM的內(nèi)皮功能障礙發(fā)揮保護(hù)作用。

高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷與ROS的過(guò)量生成有關(guān)，因?yàn)楦哐且l(fā)的ROS會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、一氧化氮生物活性降低和內(nèi)皮依賴性血管舒張障礙［16-17］。ROS由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶產(chǎn)生，并被內(nèi)源性抗氧化劑SOD清除。沉默Salusin-β 表達(dá)能有效降低血管內(nèi)ROS 的產(chǎn)生［18］。Salusin-β可通過(guò)激活NADPH 氧化酶衍生的ROS 生成和抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活及NO釋放，減弱內(nèi)皮依賴性血管舒張活性［13］。NF-κB 是一種轉(zhuǎn)錄因子，可被細(xì)胞因子、ROS、細(xì)菌或病毒產(chǎn)物等多種刺激物激活。激活的NF-κB 易位到細(xì)胞核中并刺激相關(guān)基因表達(dá)，在DM 的發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)也參與了DM 血管并發(fā)癥的發(fā)病過(guò)程［19］。已有研究顯示，Salusin-β可通過(guò)誘導(dǎo)NOX2衍生的ROS產(chǎn)生和NF-κB p65的核易位，加重糖尿病心肌病的心臟炎癥反應(yīng)［6］，并通過(guò)激活NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［7］。本研究結(jié)果亦顯示，DM 大鼠胸主動(dòng)脈IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平均較NC 組上調(diào)，并且DM 大鼠細(xì)胞核NF-κB p65蛋白水平較NC組增加，細(xì)胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白水平較NC 組減少，沉默Salusin-β的表達(dá)后這些指標(biāo)水平逆轉(zhuǎn)，表明Salusin-β可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Sun等［18］在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中研究顯示，在高糖處理的H9c2細(xì)胞中加入NADPH 氧化酶抑制劑或NF-κB抑制劑可阻止Salusin-β 誘導(dǎo)的炎癥和NF-κB p65 的核易位，進(jìn)而減輕H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Zhao 等［6］發(fā)現(xiàn)NOX2 小干擾RNA 轉(zhuǎn)染、ROS 清除劑、NADPH 氧化酶和NF-κB 抑制劑可阻止Salusin-β 誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞ROS 產(chǎn)生和NF-κB p65 核易位，減輕血管平滑肌細(xì)胞遷移和血管損傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生。因此，筆者認(rèn)為Salusin-β對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生促炎作用，抗Salusin-β 治療可能是治療DM 的內(nèi)皮損傷的新策略。

研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Salusin-β 表達(dá)可通過(guò)降低miR-155-5p表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)積聚，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞［20］；且miR-155-5p表達(dá)的下調(diào)與糖尿病腎病小鼠中FBG 水平的降低有關(guān)［21］。本研究結(jié)果亦顯示，沉默Salusin-β可降低DM大鼠FBG水平，考慮可能原因?yàn)镾alusin-β對(duì)DM大鼠FBG的調(diào)控作用與miR-155-5p有關(guān)，在后續(xù)的研究中將對(duì)此進(jìn)行深入分析。

綜上所述，Salusin-β 可能通過(guò)激活NOX2/ROS/NF-κB 信號(hào)通路誘導(dǎo)DM 大鼠內(nèi)皮功能障礙；沉默Salusin-β 可改善DM 大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙，其作用機(jī)制可能與下調(diào)NOX2 表達(dá)、減少ROS 的產(chǎn)生和抑制NF-κB p65的核易位有關(guān)。