基于NF-κB/MMP9信號軸研究姜黃素對卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用

呂慧芳 樊真真 汪鋆植 黃曉飛 劉正泰

卵巢癌是婦科腫瘤中最常見的一種疾病[1]，目前卵巢癌早期篩查手段有限[2]，大多數(shù)患者確診時已是晚期[3]，預(yù)后差，5年生存率較低。隨著治療手段的不斷進(jìn)步和發(fā)展，雖然手術(shù)、放化療、PARP 抑制劑和免疫治療等對卵巢癌的治療效果較好[4]，但是對于晚期伴有轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者并不能降低其死亡率。因此，探討卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，提高患者的生存質(zhì)量，是卵巢癌研究的必然趨勢。卵巢癌的發(fā)生與免疫、內(nèi)分泌和腫瘤微環(huán)境等多種因素相關(guān)[5，6]，核因子-κB（NF-κB）作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，特別是與腫瘤的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7，8]，NF-κB 的持續(xù)活化可以作為多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的一種診斷參考，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）是NF-κB 的重要靶基因，參與腫瘤的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)等多種生理病理過程[9]。NF-κB/MMP9信號軸對研究卵巢癌具有重要意義，因此，本研究基于NF-κB/MMP9信號軸探討姜黃素對卵巢癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，為進(jìn)一步尋找治療卵巢癌的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗細(xì)胞株及藥物卵巢癌SKOV3 細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫，姜黃素購自川澤科技有限公司，二甲基亞砜（DMSO）溶解姜黃素粉末。

1.2 試劑1640 培養(yǎng)基粉、進(jìn)口胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco 公司）；噻唑藍(lán)（MTT，Amresco 公司）；β-actin、p-NF-κB、MMP9 單克隆抗體（美國CST 公司）；熒光定量PCR 試劑盒、RNA 提取試劑盒、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher 公司）；LDH 檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，其他試劑均為標(biāo)準(zhǔn)分析純試劑。

1.3 實(shí)驗儀器倒置顯微鏡、酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo 公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Shelljb 公司）；臺式低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) 將SKOV3 細(xì)胞接種于1640培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），置于飽和濕度的培養(yǎng)箱（5%CO2、37℃）培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁85%左右后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，每3～4 天傳代，使細(xì)胞密度維持在85%左右，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

1.4.2 LDH 實(shí)驗檢測姜黃素對SKOV3 細(xì)胞的毒性細(xì)胞貼壁85%左右后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，制成5×104/ml 細(xì)胞混懸液，以每孔200μl 將SKOV3細(xì)胞接種于96 孔板中，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，隨機(jī)將SKOV3 細(xì)胞分為姜黃素組、對照組（未經(jīng)藥物處理的、用于后續(xù)裂解的樣品最大酶活性組）和陰性細(xì)胞組（背景空白組），姜黃素組換用終濃度分別為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L 和40μmol/L 的姜黃素培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h 和48h，根據(jù)試劑盒操作說明書，加入LDH 檢測工作液，490nm 處測定吸光度（OD），并且計算姜黃素對細(xì)胞的毒性。細(xì)胞毒性=（OD藥物處理組-OD陰性細(xì)胞組）/（OD對照組-OD陰性細(xì)胞組）×100%。

1.4.3 MTT 法檢測SKOV3 細(xì)胞活性 同方法培養(yǎng)細(xì)胞后，隨機(jī)將SKOV3 細(xì)胞分為姜黃素組和對照組，姜黃素組分別用濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L 的姜黃素培養(yǎng)液，對照組加入等量的1640 培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h 后，MTT 法檢測SKOV3 細(xì)胞的OD 值，并使用計算軟件計算SKOV3細(xì)胞的IC50值。

1.4.4 RT-PCR 檢測NF-κB、MMP9 的mRNA 表達(dá)水平 取待用的細(xì)胞接種于96 孔板中，隨機(jī)分為姜黃素組和對照組，姜黃素組分別給予濃度為10μmol/L、20μmol/L 的姜黃素培養(yǎng)液，對照組加入等量的1640 培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h 和48h 后，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，按照試劑盒說明書轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行RT-PCR 分析。采用2-△△Ct法計算NF-κB 和MMP9 mRNA 相對表達(dá)水平。在PubMed 中查找目的基因的NCBI GeneID，然后在PrimerBank 中查找GeneID 對應(yīng)的引物序列，并在NCBI 中驗證引物的特異性。

β-actin：上游引物為5'-TCCTGTGGCATCCAC GAAACT-3'，下游引物為5'-GAAGCATTTGCGGTG GACGAT-3'；NF-κB：上游引物為5'-GGTGCGGCT CATGTTTACAG-3'，下游引物為5'-GATGGCGTCT GATACCACGG-3'；MMP9：上游引物為5'-AGACCT GGGCAGATTCCAAAC-3'，下游引物為5'-CGGCAA GTCTTCCGAGTAGT-3'。

1.4.5 Western blot 檢測NF-κB、MMP9 蛋白表達(dá)水平 將SKOV3 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，隨機(jī)分為姜黃素組和對照組，姜黃素組分別給予10μmol/L 和20μmol/L 姜黃素培養(yǎng)液，對照組加入等量的1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h 和48h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，電泳分離各蛋白，并將目的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，在封閉液中封閉PVDF 膜2h，分別加入β-actin、NF-κB 和MMP9單克隆抗體，經(jīng)過孵育和洗膜后，加入二抗孵育1.5h，使用顯影儀顯影。用ImageJ 軟件對目的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析實(shí)驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 和ImageJ軟件進(jìn)行分析。計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對SKOV3 細(xì)胞毒性的影響與對照組相比，隨著劑量的增加，姜黃素對SKOV3 細(xì)胞的毒性增強(qiáng)，并具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同濃度姜黃素對SKOV3 細(xì)胞的相對毒性（±s，n=3）

表1 不同濃度姜黃素對SKOV3 細(xì)胞的相對毒性（±s，n=3）

注：與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與5μmol/L 姜黃素組相比，dP<0.01

分組24h（%）48h（%）對照組1.00±0.060.97±0.06 5μmol/L 姜黃素組1.06±0.070.98±0.03 10μmol/L 姜黃素組1.28±0.23a1.32±0.17a 20μmol/L 姜黃素組1.41±0.09bd1.63±0.04bd 40μmol/L 姜黃素組2.08±0.10bd2.58±0.34bd F 35.45044.413 P<0.001<0.001

2.2 姜黃素對SKOV3 細(xì)胞增殖的影響與對照組相比，姜黃素對SKOV3 細(xì)胞的生長具有抑制作用，隨著劑量的增加其抑制作用增強(qiáng)，并具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。通過姜黃素的OD 值，計算得出姜黃素作用于SKOV3細(xì)胞24h 的IC50值為34.5μmol/L，48h 的IC50值為28.6μmol/L。見表2。

表2 不同濃度姜黃素對SKOV3 細(xì)胞增殖的影響（±s，n=3）

表2 不同濃度姜黃素對SKOV3 細(xì)胞增殖的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，aP<0.01；與5μmol/L 姜黃素組相比，bP<0.01

分組OD 值24h48h對照組0.86±0.040.84±0.03 5μmol/L 姜黃素組0.86±0.010.82±0.02 10μmol/L 姜黃素組 0.77±0.01ab 0.62±0.02ab 20μmol/L 姜黃素組 0.60±0.03ab 0.50±0.02ab 40μmol/L 姜黃素組 0.47±0.04ab 0.40±0.03ab F 120.342174.672 P<0.001<0.001

2.3 姜黃素對SKOV3 細(xì)胞NF-κB、MMP9 mRNA表達(dá)水平的影響根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗和細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗結(jié)果，隨著姜黃素濃度增加，姜黃素對SKOV3 細(xì)胞的毒性和抑制作用增強(qiáng)，SKOV3 細(xì)胞的生長狀況變差，根據(jù)蛋白的預(yù)實(shí)驗結(jié)果，綜合考慮，因此選擇10μmol/L、20μmol/L 姜黃素進(jìn)行蛋白和mRNA 的檢測。RT-PCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，在10μmol/L 時，姜黃素可以顯著抑制SKOV3 細(xì)胞中MMP9 mRNA 的相對表達(dá)，姜黃素作用24h 對NF-κB mRNA 的表達(dá)基本無影響，作用48h 可以顯著抑制NF-κB、MMP9 mRNA 表達(dá)；在20μmol/L 時，姜黃素可以顯著抑制NF-κB、MMP9 mRNA 的表達(dá)，姜黃素對NF-κB、MMP9 mRNA 的影響具有劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 不同濃度姜黃素對SKOV3 細(xì)胞NF-κB、MMP9 mRNA 相對表達(dá)的影響（±s）

表3 不同濃度姜黃素對SKOV3 細(xì)胞NF-κB、MMP9 mRNA 相對表達(dá)的影響（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與10μmol/L 姜黃素組相比，cP<0.05，dP<0.01

分組24h48h NF-κBMMP9NF-κBMMP9對照組0.99±0.02 0.99±0.081.00±0.12 1.01±0.12 10μmol/L姜黃素組0.96±0.01 0.67±0.07b 0.77±0.13a 0.54±0.14b 20μmol/L姜黃素組 0.84±0.04bd 0.56±0.02bc 0.46±0.10bc 0.31±0.07bc F 28.89638.36516.58935.400 P<0.001<0.001<0.001<0.001

2.4 姜黃素對SKOV3 細(xì)胞p-NF-κB、MMP9 蛋白表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，在10μmol/L 時，姜黃素可以顯著抑制MMP9 蛋白的表達(dá)，姜黃素作用24h 對p-NF-κB 蛋白的表達(dá)基本無影響，作用48h 可以顯著抑制p-NF-κB、MMP9 蛋白表達(dá)；在20μmol/L 時，姜黃素可以顯著抑制p-NF-κB、MMP9 蛋白表達(dá)，姜黃素對p-NFκB、MMP9 蛋白的影響具有劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表4。

表4 不同濃度姜黃素對SKOV3 細(xì)胞中p-NF-κB、MMP9蛋白相對表達(dá)的影響（±s，n=3）

表4 不同濃度姜黃素對SKOV3 細(xì)胞中p-NF-κB、MMP9蛋白相對表達(dá)的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較，aP<0.01；與10μmol/L 姜黃素組相比，bP<0.01

分組24h48h p-NF-κB MMP9p-NF-κB MMP9對照組0.83±0.04 0.90±0.020.46±0.01 0.98±0.02 10μmol/L姜黃素組0.85±0.02 0.62±0.02a 0.35±0.01a 0.72±0.01a 20μmol/L姜黃素組0.65±0.04ab 0.28±0.01ab 0.03±0.01ab 0.06±0.01ab F 27.703756.6343354.0032854.334 P<0.001<0.001<0.001<0.001

圖1 不同濃度姜黃素作用24h、48h 時SKOV3 細(xì)胞中p-NF-κB、MMP9 蛋白表達(dá)水平

3 討論

姜黃素是從姜黃中提取的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和清除自由基等多方面的藥理作用[10]，應(yīng)用價值較高。姜黃素的開發(fā)應(yīng)用主要集中在保肝、抗炎方面，近年來對姜黃素在腫瘤方面的研究引起廣泛關(guān)注，有多項研究表明，姜黃素可抑制乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖[11～14]。姜黃素抑制癌細(xì)胞增殖是多信號通路參與的過程[13～16]，因此對姜黃素在腫瘤方面的不斷研究，為姜黃素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

NF-κB 通路參與癌癥發(fā)生發(fā)展的侵襲轉(zhuǎn)移、自噬凋亡、血管生成及炎癥等多種病理過程[17]，并且與腫瘤微環(huán)境的形成以及藥物的耐藥密切相關(guān)。已有研究表明，NF-κB 的下調(diào)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的生長和遷移[18]，姜黃素通過激活A(yù)MPK、抑制NF-κB 和MMP9 來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲[19]。姜黃素通過調(diào)節(jié)NF-κB 和JAK2/STAT3 信號通路減輕急性腎損傷的炎癥和細(xì)胞凋亡[20]。姜黃素能夠抑制SKOV3 細(xì)胞的侵襲和遷移，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的自噬和凋亡[21，22]，從而達(dá)到治療卵巢癌的目的。孫桂霞等[23]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖具有時間與濃度依賴性。以上研究結(jié)果表明，姜黃素對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，本研究結(jié)果表明，姜黃素對SKOV3 細(xì)胞的毒性增強(qiáng)，并具有劑量依賴性，姜黃素可以顯著降低卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的存活率，并具有劑量依賴性，與上述結(jié)果一致。

已有研究表明MMP9 與腫瘤細(xì)胞的遷移、血管的生成以及轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)[24]，MMP9 既具有促腫瘤活性又具有腫瘤抑制功能，MMP9 的表達(dá)水平與癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。姜黃素能夠抑制小鼠宮頸癌皮下移植瘤模型外周血和腫瘤組織MMP2、MMP9、VEGF 的表達(dá)[25]。姜黃素聯(lián)合紫杉醇能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞遷移侵襲能力，姜黃素能夠降低裸鼠移植瘤組織中MMP9 蛋白和mRNA 的表達(dá)[26]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，姜黃素以劑量依賴的方式顯著降低p-NF-κB 和MMP9 蛋白表達(dá)，NF-κB 和MMP9 mRNA 的相對表達(dá)水平與蛋白表達(dá)結(jié)果相一致，提示姜黃素可能通過抑制NF-κB/MMP9信號軸，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，可能是治療卵巢癌的潛在藥物。

綜上所述，姜黃素可能通過抑制NF-κB/MMP9通路抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，對卵巢癌有一定的療效，由于姜黃素具有多種藥理作用且其作用機(jī)制復(fù)雜、本身固有的理化性質(zhì)等多種因素的影響，姜黃素在體內(nèi)外的抗腫瘤作用還有待于臨床進(jìn)一步研究。