外源褪黑素誘導下Hippo信號通路調控山羊絨生長mRNA和lncRNA的生物信息學分析

賈純琰 付紹印 麗 春 張文廣

(1.內蒙古農業大學 動物科學學院/內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室, 呼和浩特 010018;2.內蒙古農業大學 職業技術學院, 內蒙古 包頭 014109;3.內蒙古農牧業科學院, 呼和浩特 010031;4.內蒙古民族大學 動物科技學院, 內蒙古 通遼028000;5.內蒙古農業基因組大數據工程研究中心, 呼和浩特 010000)

絨山羊基因組中潛藏著大量不能翻譯成蛋白質,但可轉錄成RNA并在RNA水平行使調控功能的非編碼RNA。目前對褪黑素調控山羊絨生長的非編碼RNA的研究逐漸增多。褪黑素通過調節miRNA的表達誘導內蒙古絨山羊二次生絨[16];通過調節lncRNA MTC的表達激活NF-κB信號通路,從而調控遼寧絨山羊毛囊發育與羊絨生長[17];通過改變let-7家族重要成員的表達影響相應靶基因的表達,進而調控內蒙古絨山羊皮膚毛囊的周期性生長[18];與lncRNA lnc552通過Wnt信號通路調控陜北白絨山羊毛囊干細胞增殖與分化[19]。

在以往的褪黑素促山羊絨生長的研究中,更多關注能編碼蛋白的mRNA功能,對不參與蛋白編碼的lncRNA的功能研究較少;且以往的研究模式多為單個基因,很少從整體的、系統的角度研究所有基因間的互作;而以往研究調控山羊絨生長的信號通路中很少聚焦Hippo信號通路。Hippo信號通路對平衡哺乳動物皮膚生長和分化,調節毛囊形態發生至關重要[20],也是哺乳動物組織生長發育和分化過程中整合激素的一個關鍵元素。褪黑素信號和Hippo信號通路之間存在潛在的串擾[21]。本研究旨在從轉錄組學層面全面挖掘褪黑素作用下調控山羊絨生長的mRNA和lncRNA,揭示調控山羊絨生長的關鍵信號通路,可視化受Hippo信號通路調控的山羊絨生長候選基因集的mRNA和lncRNA網絡調控關系,以期為深入探索褪黑素促絨生長的機理提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

6只成年試驗母羊選自內蒙古罕山白絨山羊種羊場,隨機分為對照組(C1、C2、C3)和褪黑素處理組(M1、M2、M3)各3個生物學重復。在阿魯科爾沁旗牧戶家放牧飼養。收牧后每天進行補飼,粗飼料以苜蓿草、玉米秸稈和當地草地上的雜草為主,精料主要是玉米。以自然年(完整的絨毛生長周期)為試驗周期,每隔一個月按照每千克體重2 mg的劑量,使用獸用皮下埋植器(江蘇泰興市醫用器械廠)在試驗羊(M1、M2、M3)耳后皮下埋植褪黑素(中國農業科學院左家特產研究所研制)。每月用剪毛剪刀在試驗羊肩胛骨后緣接近體中線處貼近皮膚剪下1 cm×1 cm 面積的全毛,并用剃刀將皮膚上殘留的絨毛刮干凈,酒精擦拭、碘酒消毒,用手術刀片割取1 cm×1 cm 面積的皮膚樣本(傷口同時迅速涂抹云南白藥粉止血),迅速放入5 mL無菌凍存管中,立即保存于液氮罐帶回實驗室,再轉入-80 ℃冰箱保存。對照組和褪黑素處理組全年12個月的樣本分別記為C1～C12和M1～M12。

1.2 方法

1.2.1 RNA制備、文庫構建、上機測序

使用TRIZOL(Invitrogen)對72份皮膚組織樣本進行RNA提取。RNA Nano 6 000試劑盒(Agilent)檢測RNA樣品的完整性和濃度,Ribo-ZeroTM試劑盒去除rRNA,RNA文庫制備試劑盒(NEB)構建cDNA文庫,Illumina HiSeq 2500測序儀進行雙端測序。

1.2.2 質控、組裝轉錄組

對日光溫室茄子栽培技術進行研究，特別是在育苗、定植、施肥、澆水以及后期的收獲和管理中要科學分析，并借助生物防治以及化學防治的方式防治病蟲害，避免大面積的病蟲害感染影響茄子的產量和質量。

使用FASTQC軟件對RNA-seq產生的原始下機序列(Raw Reads)質控得到高質量序列(Clean Reads)。Bowtie2(v2.2.3)程序建立參考基因組的索引,山羊參考基因組(CHIR_2.0)及基因組gtf注釋文件從NCBI下載(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=goat),Tophat2(v2.1.1)程序將雙端測序的 clean reads比對到參考基因組[22]。Cufflinks (v2.2.1) 程序依托參考基因組的gtf注釋文件組裝出轉錄組[23]。

1.2.3 篩選差異表達mRNA和lncRNA

使用Cuffdiff (v2.2.1) 程序分析絨山羊皮膚中自然年每月對照組和埋植組的差異表達mRNA(Differentially expressed mRNA, DE-mRNA)和轉錄本(FDR<0.05)[24],Cuffcompare (v2.2.1) 程序對差異表達轉錄本進行分類,篩選類別代碼是“i”、“j”、“o”、“u”、“x”的作為新轉錄本的候選。CPAT (v1.2.2)程序和在線CPC (http:∥cpc.cbi.pku.edu.cn)識別差異表達lncRNA(Differentially expressed lncRNA, DE-lncRNA)。

1.2.4 DE-mRNA和DE-lncRNA的PCA及WGCNA分析

2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA表達量數據的主成分分析(Principal component analysis, PCA)由R(v3.4.0)軟件完成。依據WGCNA官網教程(http:∥www.genetics.ucla.edu/labs/horvath/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA)由R軟件(v3.4.0)完成DE-mRNA和DE-lncRNA的WGCNA分析[25]。函數PickSoftThreshold進行無尺度拓撲分析,選擇軟閾值β=7調用函數adjacency計算基因間的鄰接性,函數TOMdist將鄰接矩陣轉換為拓撲重疊矩陣(Topological overlap matrix, TOM)[26]。基于TOM矩陣調用函數hclust繪制基因聚類樹狀圖,聚類樹的分枝是表達模式相似的一組基因即基因模塊[27]。函數ModuleEigengenes計算模塊的特征基因值,通過模塊特征基因值的相關性對模塊聚類以研究模塊之間的關系。采用基于Java運行環境的Cytoscape(v3.6.0)軟件插件ClueGo(v3.4.2)進行基因模塊的功能富集分析[28]。選取平衡哺乳動物皮膚生長和分化、調節哺乳動物毛囊形態發生的Hippo信號通路基因模塊進行深入分析[29]。

1.2.5 可視化調控山羊絨生長的候選基因集

由R軟件 (v3.4.0) 導出單個目標模塊的全部加權網絡關系,即對照組品紅色(Magenta)基因模塊,埋植組深藍色(Mid-night-blue)、棕褐色(Tan)和橙色(Salmon)基因模塊。Excel(v2016)篩選對照組品紅色(Magenta)基因模塊邊(edges)的信息文件中,與富集到Hippo信號通路的17個基因、皮膚發育的18個基因、細胞周期的14個基因、中間纖維的14個基因中的每一個基因Weight值(即TOM值)排名Top10的基因。埋植組操作同上。

1.2.6 調控山羊絨生長候選基因集的功能透視

由R軟件(v 4.1.2)AnnotationHub程序包構建山羊OrgDb,clusterProfiler程序包獲取山羊GO數據庫里GO.BP皮膚發育和GO.CC中間纖維的gene list[30]。KEGGREST程序包獲取山羊Hippo信號通路chx04390、細胞周期chx04110、氧化磷酸化chx00190、Wnt信號通路chx04310的gene list。dplyr程序包制作gmt文件給GSEA(Gene set enrichment analysis)軟件(v 4.1.0)進行分析。R軟件(v4.1.2)pheatmap程序包完成候選基因集與樣本的關聯分析。候選基因集中轉錄因子和轉錄輔因子的注釋基于動物轉錄因子數據庫(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB)[31]。

2 結果與分析

2.1 受外源褪黑素誘導的絨山羊皮膚中DE-mRNA和DE-lncRNA

分析埋植組和對照組的全年絨山羊皮膚組織樣本共篩選得到2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA(FDR<0.05)。DE-mRNA(圖1(a))和DE-lncRNA(圖1(b))火山圖的每個點分別代表1個mRNA和1個lncRNA。與對照組相比,受外源褪黑素影響,表達量顯著上調2倍及以上的mRNA有522個(圖1(a)紅點)、lncRNA有128個(圖1(b)紅點),表達量顯著下調2倍及以上的mRNA有400個(圖1(a)綠點)、lncRNA有81個(圖1(b)綠點),表達量上調及下調小于2倍的mRNA有1 102個(圖1(a)灰點)、lncRNA有120個(圖1(b)灰點)。

圖1(a)和圖1(b)紅色點表示上調2倍及以上的mRNA和lncRNA即log2FC≥1;綠色點表示下調2倍及以上的mRNA和lncRNA即log2FC≤-1;log2FC介于-1和1之間的mRNA和lncRNA用灰色點表示。The red dots in figures 1(a) and 1(b) indicated that mRNA和lncRNA were up-regulated by two times or more, i.e. log2FC≥1; the green dots indicated that mRNA和lncRNA were down-regulated by two times or more, i.e. log2FC≤-1; the mRNA和lncRNA with log2FC between -1 and 1 were represented by gray dots.圖1 受外源褪黑素誘導的絨山羊皮膚中差異表達mRNA(a)和差異表達lncRNA(b)的火山圖Fig.1 Volcano plot of DE-mRNA (a) and DE-lncRNA (b) induced by exogenous melatonin in cashmere goat skin

2.2 受外源褪黑素誘導的絨山羊皮膚中DE-mRNA和DE-lncRNA的PCA分析

基于2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA的RNA-Seq表達量數據共同加權得到主成分1(Dim1)和主成分2(Dim2),埋植組和對照組的全年24個樣本聚類的二維PCA散點圖(圖2)。Dim1 和Dim2分別占總體方差變異的39.9%和12.8%,Dim1+Dim2占總體方差的50%以上,既實現了降低數據維度為二維,又保證了信息損失最小。與埋植組相比,對照組樣本更離散(紅色散點),對照組來自正常生理狀態下絨山羊皮膚組織,對次級毛囊生長周期的變化更敏感,5～7月(生長前期)、8～9月(生長期)、10～12月(生長旺盛期)、1～2月(退行期)、3～4月(休止期)聚集在一起,這應答了次級毛囊的正常生長周期。相比之下,埋植組的樣本處于相同的狀態(外源褪黑素誘導下)聚類在一起(綠色散點),4～7月(產夏季絨)、8～12月(產冬季絨)、1～3月(休止期)聚在一起,這應答了褪黑素埋植組的產絨周期。此結果表明DE-mRNA和DE-lncRNA應答了絨山羊皮膚次級毛囊的生長周期。

對照組和埋植組全年12個月的樣本分別以C1～C12和M1～M12表示。The 12-month samples of the control and implanted group were expressed as C1-C12 and M1-M12, respectively.圖2 受外源褪黑素誘導的絨山羊皮膚中差異表達mRNA和差異表達lncRNA的PCA散點圖Fig.2 PCA scatter plot of DE-mRNA and DE-lncRNA induced by exogenous melatonin in cashmere goat skin

2.3 受外源褪黑素誘導的絨山羊皮膚中DE-mRNA和DE-lncRNA的WGCNA分析

2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA經WGCNA分析,對照組和埋植組分別得到7個和9個高度關聯的基因模塊,每個基因模塊都有唯一的顏色標識,其余關聯較差的基因被歸入灰色模塊結果見表1。表1的基因模塊經ClueGo功能富集分析,選取富集到Hippo信號通路的對照組品紅色(Magenta)模塊和埋植組深藍色(Mid-night-blue)模塊進行深入分析,目標模塊顯著富集到的GO條目或KEGG通路結果見表2。

表1 受外源褪黑素誘導的絨山羊皮膚中mRNA和lncRNA在各基因模塊的分布Table 1 Assignment of mRNA和lncRNA in each gene module induced byexogenous melatonin in cashmere goat skin

表2 受外源褪黑素誘導的絨山羊皮膚中目標基因模塊的功能注釋Table 2 Functional annotations enriched in target modules induced by exogenous melatonin in cashmere goat skin

表2(續)

對照組基因模塊的特征基因樹狀圖(圖3(a))與基因模塊間的鄰接熱圖(圖3(a))品紅色(Magenta)Hippo目標基因模塊是獨立發揮作用,不與其他基因模塊互作。外源褪黑素改變了基因模塊間的相互作用模式,埋植組基因模塊的特征基因樹狀圖(圖3(b))與基因模塊間的鄰接熱圖(圖3(b))深藍色(Mid-night-blue)Hippo目標基因模塊與橙色(Salmon)和棕褐色(Tan)基因模塊存在互作,且基因模塊間特征基因相關度在0.5以上。

此結果表明深藍色(Mid-night-blue)Hippo基因模塊是與橙色(Salmon)氧化磷酸化基因模塊和棕褐色(Tan)細胞周期基因模塊協同發揮作用。

2.4 可視化褪黑素調控山羊絨生長的候選基因集

褪黑素調控山羊絨生長候選基因集的mRNA和lncRNA共表達調控網絡見圖4,由3個獨立的同心圓網絡組成,同心圓從左至右分別對應圖3(b)的深藍色(Mid-night-blue)Hippo基因模塊、棕褐色(Tan)細胞周期基因模塊與橙色(Salmon)氧化磷酸化基因模塊。居左的同心圓是82個mRNA和20個lncRNA的共表達調控網絡,由內而外,第一環紫色V形節點是目標生物學過程皮膚發育、目標通路Hippo信號通路;第二環橙色菱形節點是對照組和埋植組共有的7個lncRNA;第三環淺綠色菱形節點是埋植組特有的13個lncRNA;第四環紅色圓形節點是對照組和埋植組共有的51個mRNA;第五環綠色圓形節點是埋植組特有的31個mRNA。居中的同心圓是87個mRNA和27個lncRNA的共表達調控網絡,由內而外,第一環紫色V形節點是目標細胞組分中間纖維、目標通路細胞周期;第二環橙色菱形節點是對照組和埋植組共有的7個lncRNA;第三環淺綠色菱形節點是埋植組特有的20個lncRNA;第四環紅色圓形節點是對照組和埋植組共有的46個mRNA;第五環綠色圓形節點是埋植組特有的41個mRNA。居右的同心圓是22個mRNA和2個lncRNA的共表達調控網絡,由內而外,第一環紫色V形節點是目標通路氧化磷酸化;第二環淺綠色菱形節點是埋植組特有的2個lncRNA;第三環綠色圓形節點是埋植組特有的22個mRNA。此結果表明外源褪黑素誘導下,這191個mRNA和49個lncRNA由Hippo信號通路、細胞周期和氧化磷酸化過程介導,協調互作調控山羊絨生長的共表達網絡關系。

圖3 不同組基因模塊的特征基因樹狀圖與基因模塊間的鄰接熱圖Fig.3 Eigengene dendrogramand adjacency heatmap of gene module of different groups

紫色V形節點表示通路、生物學過程、細胞組分;紅色和橙色節點分別表示在對照組和埋植組共有的mRNA和lncRNA;綠色節點和淺綠色節點分別表示在埋植組特有的mRNA和lncRNA。圓形節點表示mRNA;菱形節點表示lncRNA。節點的大小表示基因的連通度,節點越小基因的連通度越低。The purple V-shaped nodes indicated pathways, biological processes and cell components; The common mRNA and lncRNA in the control group and the implanted melatonin group were indicated by red and orange nodes respectively; The exclusive mRNA and lncRNA in the implanted melatonin group were indicated by green and light green nodes respectively. The round nodes indicated mRNA; The diamond nodes indicated lncRNA. Node size indicated the degree of gene, low degree map to small node.圖4 褪黑素調控山羊絨生長候選基因集mRNA和lncRNA的共表達網絡Fig.4 Co-expression networks of mRNA and lncRNA induced by melatonin in the candidate gene set that regulated cashmere growth

2.5 調控山羊絨生長候選基因集的功能透視

2.5.1 候選基因集的GSEA分析

調控山羊絨生長候選基因集的GSEA分析結果見表3,與埋植組相比,對照組更加富集于皮膚發育生物學過程和中間纖維細胞組分;與對照組相比,埋植組更加富集于Hippo信號通路、Wnt信號通路、細胞周期、氧化磷酸化和呼吸鏈復合體細胞組分。

皮膚發育和中間纖維的富集評分(Enrichment score,ES)為正值,這2個基因集的成員在對照組呈上調趨勢。候選基因集在對照組的表達與皮膚發育生物學過程顯著關聯(|NES|>1且FDR<25%),與中間纖維細胞組分關聯(|NES|>1且FDR=0.41)(表3)。此結果表明這2個基因集成員對候選基因集在正常生理狀態下的山羊絨生長有貢獻。

Hippo信號通路、Wnt信號通路、細胞周期、氧化磷酸化和呼吸鏈復合體的ES為負值,這5個基因集的成員在埋植組呈上調趨勢。候選基因集在埋植組的表達與Hippo信號通路(|NES|>1且FDR<25%)、Wnt信號通路(|NES|>1且FDR<25%)、細胞周期(|NES|>1且FDR<25%)顯著關聯,與氧化磷酸化(|NES|>1且FDR=0.30)和呼吸鏈復合體細胞組分(|NES|>1且FDR=0.38)關聯(表3)。此結果表明這5個基因集成員對候選基因集在外源褪黑素誘導下的山羊絨生長有貢獻。

表3 候選基因集GSEA富集評分Table 3 GSEA enrichment score of candidate gene set

2.5.2 定量候選基因集與樣本的關聯

調控山羊絨生長候選基因集的253個mRNA和59個lncRNA與樣本的關聯熱圖,及候選基因集的核心基因、轉錄因子、轉錄輔因子之間的聚類模式見圖5。對照組和埋植組候選基因集的全部312個基因被聚成兩類(圖5),一類為212個mRNA和50個lncRNA與正常山羊絨生長期(8～12月)的樣本呈正相關,這262個基因促進正常生理狀態下的山羊絨生長;另一類為41個mRNA和9個lncRNA與正常山羊絨生長期(8～12月)的樣本呈負相關,這50個基因負調控山羊絨生長。對照組絨山羊8月開始長絨,8～12月皮膚次級毛囊處于生長期及生長旺盛期。結果表明,候選基因集與對照組樣本的關聯結果與生理性狀一致,候選基因集參與調控正常生理狀態下絨山羊產絨期的絨生長。絨山羊皮膚埋植褪黑素后,候選基因集的312個基因間的互作模式發生了明顯改變,這些基因以不同于對照組的方式被聚成兩類(圖5),協調互作與非生絨期(4～7月)及正常生絨期(8～12月)的樣本呈正相關,在外源褪黑素誘導下促進非產絨期和正常產絨期的絨生長。埋植褪黑素后改變了羊絨的生長模式,除正常生絨期外,在4～7月(非產絨期)也生長了一批羊絨。結果表明,候選基因集與埋植組樣本的關聯結果與生理性狀一致,證明外源褪黑素誘導下候選基因集參與調控非產絨期和正常產絨期的絨生長。

C表示對照組;M表示埋植組;Hub表示核心基因;TF表示轉錄因子;TF co表示轉錄輔因子。每一行對應一個基因,每一列對應一個樣本。熱圖的每個單元格根據圖例顏色展示基因與樣本的相關性。C represented the control group; M represented the implant group; Hub represented hub gene; TF represented transcription factor; TF co(TF cofactor) represented transcription cofactor. Each row corresponded to a gene, column to a sample. Each cell of heat map was color-coded by correlation according to the color legend.圖5 調控山羊絨生長候選基因集與樣本的關聯熱圖Fig.5 The heat map between the gene set that regulated cashmere growth and samples

3 討 論

褪黑素是由皮膚產生并可在皮膚中進行代謝的胺類激素,可促進山羊絨生長。lncRNA在調節生物體內的生物學過程中發揮著重要作用[32]。同為研究褪黑素介導lncRNA對山羊絨生長的影響,Jin等[17]研究的皮膚樣本取自山羊絨生長期,而本研究不僅對非羊絨生產期的山羊皮膚進行了試驗,還將試驗范圍擴大到非羊絨生產期之前和之后的整個羊絨生長周期。與10～3月相比,4～9月的DE-mRNA和DE-lncRNA數量較多, 其中5月最多(DE-mRNA共計1 178個,DE-lncRNA共計191個),其余11個月(除5月)的DE-mRNA共2 293個和DE-lncRNA共331個,其余11個月(除5月)DE-mRNA的平均數和標準差分別為208.45和200.93,1 178大于811.24(μ±3σ),P<0.01,其余11個月(除5月)DE-lncRNA的平均數和標準差分別為30.09和23.97,191大于101.99(μ±3σ),P<0.01,根據Z檢驗5月與其余11個月相比差異極顯著。這說明與對照組相比,受外源褪黑素影響絨山羊皮膚組織在5月發生了極其重要的生理事件。在正常生理狀態下,罕山白絨山羊5月脫絨,7月體表開始長出過冬絨毛。埋植褪黑素導致提前一個月脫絨,5月體表已經長出夏季絨毛。發現DE-lncRNA和DE-mRNA在全年每月分布的變化趨勢相似,推測受外源褪黑素影響lncRNA和mRNA協同發揮作用調控山羊絨生長,這有助于更深入了解lncRNA在絨山羊皮膚中的功能。分析發現基因間lncRNA的數量最多,其他類型lncRNA較少。基因間lncRNA的轉錄激活機制與mRNA類似,以組織特異性的方式表達[33],比蛋白編碼基因更具組織特異性,在多種脊椎動物中都是保守的。這表明了基因間lncRNA功能的重要性。在外源褪黑素誘導下,有176個基因間lncRNA在絨山羊皮膚組織特異性表達,提示其可能以保守穩定地方式參與調控山羊絨生長。

同為研究褪黑素介導mRNA和lncRNA對山羊絨生長的影響,Ge等[34]利用STRING數據庫(https:∥string-db.org)分析mRNA和lncRNA的相互作用網絡,STRING數據庫基于文獻研究報道的試驗驗證的直接物理互作或生物信息學方法推斷的間接功能相關來檢索基因間可能的相互作用,本研究使用WGCNA分析方法基于基因的加權相關系數,將具有相似表達模式的基因歸為同一個模塊,為研究mRNA和lncRNA之間的共表達網絡調控關系提供了新途徑,相似表達模式的基因在功能上具有相關性,這有助于挖掘山羊產絨這一復雜性狀相關的弱效應mRNA和lncRNA,也為注釋家畜lncRNA提供了新思路。Zhang等[20]和Watt等[35]提出Hippo信號通路調節哺乳動物毛囊形態發生、器官大小和發育,Federica等[21]提出Hippo信號通路和褪黑素信號存在串擾,本研究結果證明了褪黑素和Hippo信號通路間存在互作,推測褪黑素可能通過Hippo信號通路調節絨山羊皮膚次級毛囊的大小和發育,從而調控羊絨在非生絨期的生長。山羊絨生長的生物學過程和調節網絡如此復雜,傳統的基因表達分析策略側重于識別在兩種生物學狀態之間表現出差異的單個基因,無法檢測到代謝途徑、轉錄程序和應激反應等生物過程,本研究使用GSEA在基因集的水平上分析調控山羊絨生長的候選數據,考慮檢測到的基因數量、它們的相對排名和注釋到感興趣通路的基因數量,統計檢驗顯著差異的通路,將大的候選基因列表總結為一個較小的更容易解釋的通路列表[36]。而不是僅考慮那些變化倍數或顯著性高于臨界值的基因,保留了基因間相關性,提供了更準確的模型,有助于將先驗知識與新生成的數據聯系起來,發現基因型與表型的關系,揭示正常生理狀態下和外源褪黑素誘導下基因的集體行為,驗證了候選基因集調控山羊絨生長的功能。屬于同一基因集或通路的基因更可能以協調的方式表達,并表現出一定程度的相關性。包含相關基因的基因集更一致,會比不一致、不相關的基因集提供更高的生物信號。候選基因集在正常生理狀態下和外源褪黑素誘導下與樣本的關聯結果與山羊絨生長周期一致,同樣驗證了候選基因集調控山羊絨生長的功能。在候選基因集里發現了16個已經被報道的毛囊發育和絨毛生長的調節因子:FZD1、FZD7、FZD10、TCF7L2[37],WNT11、WNT2B[38]、LEF1[39]、FGFR2[40]、BMP2、BMP4[41]、FOXN1[42]、HOXC13[43]、SOX9[44]、GPRC5D、PRR9、LRRC15[45],其中TCF7L2、LEF1、FOXN1、HOXC13和SOX9是轉錄因子,FGFR2是轉錄輔因子,LEF1、GPRC5D、LRRC15、FOXN1、HOXC13和WNT11是核心基因,這也證實了分析方法的可靠性。基因對生物遺傳性狀的控制具有時間和空間復雜性,在生命體內生物學通路之間存在相互作用的復雜關系網,而探索褪黑素促絨生長的更多基因、更多pathway依賴于研究技術和研究方法的不斷創新與完善。

4 結 論

本研究篩選在褪黑素影響下全年每月絨山羊皮膚組織樣本共得到2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA,從轉錄組水平對絨山羊特有的產絨性狀,在基因集層面揭示了在外源褪黑素誘導下,Hippo信號通路調控山羊絨生長的關鍵lncRNA及mRNA和lncRNA多基因之間的互作關系,從2個不同角度透視了候選基因集調控山羊絨生長的生物學功能,為進一步研究外源褪黑素促山羊絨生長的機制提供了參考。