基于網絡藥理學和生信分析探討紫蘇醛抗慢性粒細胞白血病的潛在作用機制

王金鳳，江榮松，艾尼娃爾·艾克木, ，張偉怡*

（1. 新疆醫科大學 藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆維吾爾醫學專科學校，新疆 和田 843000）

慢性粒細胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）起源于髓系祖細胞，其特點是異常的造血祖細胞不受控制的增殖，是一種罕見的骨髓增生性腫瘤[1-2]。其特征是9號染色體上的ABL1基因和22號染色體上的BCR基因融合形成融合基因BCRABL，由其編碼的BCR/ABL融合蛋白可持續增強酪氨酸激酶的活性[3-4]，進一步激活下游增殖、分化等相關信號通路，引起疾病的惡化，導致腫瘤的發生與發展。隨著酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）在國內廣泛應用，極大改善了CML的治療效果，患者生存時間和生活質量都得到了明顯改善，10年生存率由20 %左右提高到80 %～90 %[5]。但仍有20 %～30 %的患者存在原發藥物反應不良或出現繼發耐藥[6-8]。

紫蘇醛（perillaldehyde，PAE）是從紫蘇[Perilla frutescens(L.)Britt.][9]中提取的主要活性成分之一，可作為食品添加劑，也是生產香精和香水的主要原料[10]。由于良好的抗氧化活性，可作為有機水果和食品保鮮劑[11]。藥理研究表明，PAE具有較強的抗腫瘤[12-13]、抗抑郁[14]、抗炎[15-16]等多種藥理作用。然而，PAE在治療CML中的作用尚未見報道。本研究采用網絡藥理學和分子對接方法，以PAE為研究對象，預測分析抗CML的潛在靶點，借助GEO數據庫分析CML患者和健康人群的差異基因，并通過體外試驗加以驗證。

1 儀器與材料

1.1 儀器

VD-650超凈工作臺（上海尚道）；Infinite-EPlex全波長酶標儀（Tecan Trading公司）；BKQZ75I立式壓力蒸汽滅菌器（山東博科）；37XB倒置顯微鏡（上海豫光）；PowerPac Basic凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；690BR031901半干轉電轉儀（美國Bio-Rad公司）；EDGE V.070化學發光成像儀（法國Vilber公司）。

1.2 材料

紫蘇醛（純度≥98 %，Solarbio）；二甲基亞砜（DMSO，Solarbio）；蛋白裂解液（RIPA，Solarbio）；苯甲基磺酰氟（PMSF，Solarbio）；蛋白上樣緩沖液（Solarbio）；脫脂奶粉（Solarbio）； IMDM基礎培養基（Procell）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，Servicebio）；胎牛血清（FBS，Biological Industries）；青霉素和鏈霉素混合液（Biological Industries）；胰蛋白酶（VivaCell）；蛋白定量試劑盒（Biosharp）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）；ECL發光試劑盒（Millipore）；白介素8（IL-8）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；IL-8抗體（Abcam）；β-actin抗體（Bioss）；羊抗鼠HRP二抗（Bioss）。

1.3 數據庫

采用的數據庫及其網址信息見表1。

表1 數據庫

2 方法

2.1 藥物靶點獲取

通過檢索HERB（http://herb.ac.cn）、BATMAN（http://bionet.ncpsb.org.cn）、TCMSP（https://old.tcmsp-e.com）、SuperPred（https://prediction.charite.de/）數據庫分別獲取PAE的作用靶點。

2.2 疾病靶點獲取

通過檢索Genecards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET （https://www.disgenet.org/search）、DrugBank （http://www.drugbank.ca）和OMIM （http://www.omim.org）數據庫預測CML的相關疾病靶點。

2.3 PAE-CML交集靶點篩選

對上述獲得的藥物靶點、疾病靶點使用R包（VennDiagram，version 1.7.3）獲得交集基因并制作韋恩圖，得到PAE抗CML的潛在靶點。

2.4 富集分析

將上述獲得交集基因使用R包（clusterProfiler，version 4.4.1）進行基于GO及KEGG的富集分析，并使用enrichplot包（version 1.16.0）繪制條形圖及氣泡圖。

2.5 交集靶點-功能-通路的調控網絡圖

使用Cytoscape（version 3.8.2）利用GO富集的交集靶點構建交集靶點-功能的調控網絡圖；利用KEGG途徑富集的交集靶點構建交集靶點-通路的調控網絡圖。

2.6 交集靶點的PPI調控網絡圖

將潛在靶點導入STRING（https://string-db.org）數據庫，以置信度為0.4（Confidence=0.4）作為篩選條件構建蛋白互相作用（PPI）網絡。其中節點代表靶點蛋白，邊代表蛋白相互作用。

2.7 分子對接

選擇交集靶點PPI網絡中degree最高的蛋白，與PAE進行分子對接。從PDB（https://www.rcsb.org/）數據庫中下載靶點對應的蛋白質晶體結構，再從TCMSP數據庫下載活性成分的三維結構，利用AutoDockvina進行分子對接。通常對接結合能小于-1.2 kcal/mol時，證明配體與受體可較好結合。

2.8 生物信息學分析

對GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫中的GSE138883[17]和GSE5550[18]數據集進行整合分析，使用R包（limma：3.40.2）研究mRNA的差異表達。在GEO中分析調整后的P值以糾正假陽性結果并繪制火山圖。運用R軟件包pheatmap繪制表達熱圖。通過boxplot繪制正常組與CML患者組差異基因表達箱線圖。

2.9 酶聯免疫吸附測定（ELISA）

取對數生長期K562細胞，以4.0×105個/孔鋪于6孔板。實驗組分別加入200 μl紫蘇醛使其終濃度為0，25，50，100，200 μmol/L，空白對照組加入等體積的PBS，5 % CO2、37 ℃恒溫培養箱培養24 h。使用人白介素8（IL-8）ELISA試劑盒測定細胞上清中CXCL8（又稱IL-8）的含量。

2.10 蛋白質印跡（Western blot）檢測

細胞按2.9項下方法給藥干預。收集細胞，1000 r/min離心5 min，用PBS清洗細胞兩次，離心棄上清后每組加入裂解液（RIPA:PMSF=100:1）150 μl，轉移至1.5 ml EP管，冰上靜置裂解15 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，轉移至新的1.5 ml EP管中備用。制備15 %分離膠和5 %濃縮膠。將其固定于電泳槽上，槽內裝滿1×電泳緩沖液，按空白對照，0，25，50，100，200 μmol/L順序每孔上樣10 μl。電泳電壓設置為80 V，待分子量標記物（marker）明顯分開后再將電壓設置為120 V，直至藍色指示條帶靠近玻璃板底部結束。裁剪尺寸合適的PVDF膜，提前使用甲醇活化5 min使其被激活，取下玻璃板裁剪含蛋白的凝膠部分，按濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙順序壓緊，置于半干轉儀中，確保每層都不留下氣泡，設置電流為0.5 A，電轉35 min。使用5 %脫脂奶粉封閉2 h，加入IL-8抗體（1:500）或內參（β-actin）抗體（1:2000），4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗滌5次，加入二抗，室溫孵育（1:2000）1 h，TBST洗滌5次，將PVDF膜在發光液中浸潤后使用曝光儀進行曝光，保存圖片并進行定量分析。

3 結果

3.1 藥物靶點獲取結果

HERB、BATMAN、TCMSP和SuperPred數據庫分別預測得到10，30，7，8個可能作用的靶點，合并4個數據庫得到的藥物靶點，最終共得到53個藥物靶點。

3.2 疾病靶點獲取結果

在Genecards數據庫中以相關分數（relevance score）≥7獲得1178個疾病靶點，在DisGeNET、DrugBank及OMIM數據庫中分別獲得1234個、6個及1個靶點，合并4個數據庫得到的疾病靶點，最終共得到2415個疾病靶點。

3.3 PAE-CML交集靶點篩選

將上述獲得的藥物靶點和疾病靶點運用R包（VennDiagram，version 1.7.3）繪圖取得交集，共獲得18個交集靶點，見圖1。

圖1 PAE藥物靶點與CML疾病靶點Venn圖

3.4 富集分析

GO共富集到193條GO相關通路（調整后P＜0.05），其中GO-BP目錄156個，GO-CC目錄0個，GO-MF目錄37個，主要包括對類固醇激素的反應、細胞對類固醇激素刺激的反應、血管相關平滑肌收縮的調節等，見圖2。KEGG富集到18條通路（調整后P＜0.05），主要包括NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、趨化因子信號通路、脂質與動脈粥樣硬化等，見圖3。

圖2 PAE抗CML交集靶點GO分析

圖3 PAE抗CML交集靶點KEGG分析

3.5 交集靶點-功能-通路的調控網絡圖

使用Cytoscape（version 3.8.2）將GO（GOBP、GO-CC和GO-MF）富集結果按P值從小到大排序，分別取排名靠前的15個交集靶點構建交集靶點-功能調控網絡圖，網絡中包含30個GO關系項（term），15個交集靶點，共106個關系對，見圖4。使用Cytoscape（version 3.8.2）將KEGG富集結果按P值從小到大排序，構建了交集靶點-通路的調控網絡圖，網絡包含18條KEGG途徑，8個交集靶點，共54個關系對，見圖5。

圖4 PAE和CML交集靶點-功能的調控網絡圖

圖5 PAE和CML交集靶點-通路的調控網絡圖

3.6 交集靶點的PPI調控網絡圖

為了探究這18個交集靶點之間是否存在互相作用關系，將其導入到STRING（https://string-db.org）數據庫進行PPI網絡構建，得到14個蛋白的互作網關系，包括14個節點，31條邊，根據節點大小和顏色深度反應其連接度（degree）大小，見圖6。

圖6 PAE和CML交集靶點PPI調控網絡圖

3.7 分子對接

PPI網絡中連接度（degree）最高的靶點CXCL8與PAE進行分子對接，結果表明，ARG-47殘基與PAE之間存在氫鍵相互作用，對接親和力為-5.2 kcal/mol，見圖7。

圖7 蛋白質分子對接構象圖

3.8 生物信息學分析

對GSE138883與GSE5550數據集整理合并得到14例正常樣本和15例CML患者樣本，對合并后的數據進行基因差異表達分析，得到其上調及下調基因，見圖8。熱圖中明顯觀察到正常組和CML組之間有多個基因有表達差異，見圖9。再對CXCL8單獨進行表達差異比較，發現CXCL8在正常組和患者組之間有顯著表達差異，見圖10。

圖8 正常組與CML患者組差異基因表達的火山圖譜分析

圖9 正常組與CML患者組差異基因表達的熱圖

圖10 正常組與CML患者組CXCL8表達差異

3.9 ELISA

根據核心靶點篩選結果，CXCL8的連接度值最高，因此采用ELISA驗證PAE對K562細胞中CXCL8含量的影響，結果見圖11。與正常組比較，藥物干預組CXCL8（IL-8）蛋白表達量顯著下降，并呈濃度依賴趨勢。

圖11 PAE對IL-8蛋白表達量的影響

3.10 Western blot

采用Western blot驗證PAE對K562細胞中CXCL8（IL-8）含量的影響，結果見圖12。與正常組比較，藥物干預組CXCL8蛋白表達量顯著下降且呈濃度依賴趨勢，與ELISA結果一致。

圖12 PAE對IL-8蛋白表達量的影響

4 討論

網絡藥理學是以系統生物學和多向藥理學為基礎的研究方法。通過構建藥物-靶點-疾病多層次相互作用網絡[19]，研究藥物和疾病的共同靶點及其生物活性和信號通路。本研究通過PPI網絡分析PAE抗CML潛在靶點共涉及CXCL8、NR3C1、ESR1、CRP、REN、TXN、AR、NFKB1、RHOA、NR3C2等14個核心靶點，對其進行GO及KEGG生物通路富集分析主要涉及類固醇激素的反應（response to steroid hormone）、激素介導的信號通路（hormone-mediated signaling pathway）及趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）等。此外，生信分析結果表明CXCL8在CML患者和健康人群之間有顯著差異表達。

CXCL8與其受體（CXCR1/2）結合，激活多種信號通路，通過促進腫瘤細胞增殖、上皮-間質轉化促血管生成、抑制抗腫瘤免疫和影響腫瘤微環境成分[20]促進腫瘤進展。本文研究結果表明PAE能顯著降低CXCL8在慢性粒細胞白血病K562細胞中的表達，且作用呈濃度依賴性，表明PAE可通過調控CXCL8抑制K562細胞的生長，改善慢性粒細胞白血病的發生與發展。

綜上，本研究運用分子對接和生物信息學分析初步驗證網絡藥理學篩選出的最有潛力的靶點CXCL8，并通過實驗驗證CXCL8可能是PAE治療CML過程中的重要靶點。這為PAE抗CML提供了新的思路，也為天然小分子抗腫瘤藥物的研究與開發提供理論依據。