免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測宮頸鱗狀細胞癌組織中PD-1 和PD-L1 表達一致性研究

鮑書友，李麗，勞吉鋒，倪建

宮頸鱗狀細胞癌為女性常見的一種惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢，且患病人群呈年輕化趨勢，大部分患者預后不佳［1］。研究［2］指出，細胞的免疫應答與腫瘤的發生發展密切相關，特異性免疫檢測的新靶點對改善宮頸鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤預后具有積極作用。臨床研究［3］表明，激活程序性死亡分子1（PD-1）/程序性死亡分子1 配體（PD-L1）通路可促進宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤細胞免疫逃逸，抑制機體產生免疫反應。大量研究［4-6］證實，抗PD-1/PD-L1 等免疫靶點治療藥物應用于肺癌、宮頸癌等中取得良好的抗腫瘤效果。目前存在多個商品化PD-1、PD-L1 免疫組化抗體，不同抗體使用的閾值、判讀標準及檢測平臺均不同，因而也會有不同的治療選擇。本研究探究免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測宮頸鱗狀細胞癌組織中PD-1 和PD-L1的表達水平與一致性，以期為臨床檢測宮頸鱗狀細胞癌特異性免疫位點提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2019 年3 月至2021 年2 月被江陰市中醫院病理科診斷為宮頸鱗狀細胞癌的80 例患者石蠟組織標本，患者年齡25～86 歲［（65.17 ±7.63）歲］。納入標準：（1）病理診斷為宮頸鱗狀細胞癌［7］；（2）均未接受過放療或化療；（3）均接受PD-1抑制劑（納武利尤單抗注射液）治療；（4）年齡＞18 歲；（5）臨床資料完整者。排除標準：（1）合并其他類型惡性腫瘤者；（2）陰道感染性病變者；（3）近1 個月內有免疫抑制劑服用史者；（4）妊娠期或哺乳期患者；（5）合并自身免疫疾病者。該研究已經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化法 宮頸癌根治術標本取自宮頸鱗狀細胞癌組織，采用石蠟包埋組織并切片（厚度為3 μm），脫蠟、脫水，隨后實施抗原修復，加入過氧化氫阻斷液（上海艾研生物科技有限公司），孵育15～20 min 后加入磷酸鹽緩沖液（中國賽默飛世爾科技有限公司）洗滌3～4 次，3～5 min/次，再加入一抗PD-1（單克隆，克隆號MX033）與一抗PD-L1（單克隆，克隆號22C3），抗體均購自美國Abcam 公司，孵育過夜（4 ℃）。然后加入山羊抗兔二抗，采用含辣根過氧化酶標記（艾美捷科技有限公司），室溫下孵育60 min，接著加入氨基聯苯胺（上海機純實業有限公司）孵育，用蘇木精-伊紅染色，切片后脫水，最后封片。在高倍鏡下選擇陽性細胞表達較多的區域視野，實施統計學處理。結果判讀：PD-L1 主要在腫瘤間質免疫細胞或腫瘤細胞中表達，腫瘤間質免疫細胞PD-L1 陽性染色定位于細胞膜或細胞質，腫瘤細胞PD-L1 陽性染色定位于細胞膜（完全或部分膜染色）。PD-L1 陽性評分采用聯合陽性評分法（CPS），CPS=［PD-L1 陽性細胞數（巨噬細胞、淋巴細胞、腫瘤細胞）/活腫瘤細胞總數］×100，CPS≥1記為PD-L1 陽性。PD-1 主要在腫瘤間質免疫細胞與腫瘤細胞中表達，按照棕褐色、棕黃色、淡黃色、陽性著色分別記為3+、2+、1+、0，PD-1 陽性：著色3+與2+的細胞比例≥5%［8］。均由2 名經驗豐富的病理科醫師進行判定，如不一致協商決定。

1.2.2 RNAscope 原位雜交法 PD-1 與PD-L1 特異性探針均購自上海群己生物科技有限公司，采用熒光標記PD-1mRNA 與PD-L1mRNA。結果判讀：PD-1mRNA 與PD-L1mRNA 陽性表現為細胞核或細胞質中有棕黃色點，呈棕黃色顆粒狀。20 個點/細胞、16～19 個點/細胞、11～15 個點/細胞、1～10 個點/細胞、0 個點/細胞分別記為4 分、3 分、2 分、1 分、0 分，分值≥1 分記為細胞陽性［9］。均由2 名經驗豐富的病理科醫師進行判定，如不一致協商決定。

1.2.3 臨床病理資料收集 收集整理有無淋巴結轉移、有無神經侵犯、年齡、腫瘤分期（TNM）、腫瘤直徑、有無脈管侵犯。

1.2.4 預后分析 患者從首次治療結束后開始隨訪，隨訪1 年，記錄PD-1mRNA 陽性表達與PD-1mRNA陰性表達及PD-L1mRNA 陽性表達與PD-L1mRNA陰性表達的總生存時間。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計軟件分析所得數據，計數資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，采用t檢驗。采用Kappa 一致性檢驗分析RNAscope 原位雜交法與免疫組化法檢測結果的一致性，Kappa 值＜0.40 表示一致性差，0.40≤Kappa 值≤0.60 表示一致性一般，0.60＜Kappa 值≤0.08 表示一致性中等，Kappa 值＞0.80 表示一致性良好。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，二者生存曲線的差異比較行Log-rank 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測癌組織中PD-1 和PD-L1 表達一致性分析

免疫組化法結果顯示，80 例宮頸鱗狀細胞癌組織中PD-1 蛋白陽性52 例，陽性率為65.00%；PDL1 蛋白陽性60 例，陽性率為75.00%。RNAscope原位雜交法結果顯示，80 例宮頸鱗狀細胞癌組織中PD-1 蛋白陽性49 例，陽性率為61.25%；PD-L1 蛋白陽性57 例，陽性率為71.25%。免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測PD-1 表達一致性良好（Kappa=0.847，P=0.325）；免疫組化法與RNAscope原位雜交法檢測PD-L1 表達一致性良好（Kappa 值=0.861，P=0.287）。見表1、2。

表1 免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測癌組織中PD-1 表達一致性分析（例，n=80）

2.2 RNAscope 原位雜交法檢測癌組織中PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達與其臨床病理特征的關系

PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達與患者年齡、脈管侵犯、淋巴結轉移、神經侵犯、TNM 分期、腫瘤直徑無關（P＞0.05）。見表3。

表2 免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測癌組織中PD-L1 表達一致性分析（例，n=80）

表3 RNAscope 原位雜交法檢測癌組織中PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達與其臨床病理特征的關系（例，n=80）

2.3 PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達與宮頸鱗狀細胞癌患者預后的關系

隨訪1 年，80 例宮頸鱗狀細胞癌患者失訪2 例，隨訪率為97.50%。PD-1mRNA 陽性表達與PD-1mRNA 陰性表達的總生存曲線比較差異無統計學意義（χ2=0.037，P=0.847）；PD-L1mRNA 陽性表達與PD-L1mRNA 陰性表達的總生存曲線比較差異無統計學意義（χ2=0.255，P=0.636）。見圖1、2。

圖1 PD-1mRNA 陽性表達與PD-1mRNA 陰性表達的總生存曲線

圖2 PD-L1mRNA 陽性表達與PD-L1mRNA 陰性表達的總生存曲線

3 討論

有研究［10］指出，腫瘤微環境中的T 細胞浸潤狀態與宮頸癌的發生、發展與預后關系密切。目前，PD-L1、PD-1 等免疫位點已成為免疫治療宮頸癌的重要靶點。相關研究［11］表明，PD-1 為細胞表面膜蛋白，能夠結合腫瘤細胞配體PD-L1，減少機體T 細胞分化增殖，激活調節T 細胞活性，并可降低機體對腫瘤細胞的殺傷效應，而PD-1 抑制劑能夠抑制PDL1、PD-1 的表達，以及能夠抑制T 細胞耗竭，增加機體對腫瘤細胞的免疫殺傷能力，并可降低該通路對機體免疫系統的負向調控，從而改善腫瘤患者預后。有研究［12］表明，在宮頸癌細胞表面，PD-L1、PD-1 表達明顯增加，其在宮頸癌的免疫逃逸中具有重要作用。故檢測宮頸鱗狀細胞癌組織中PD-L1、PD-1 表達對于臨床開展免疫治療具有一定的臨床價值。

目前，臨床上多采用免疫組化法測定PD-1 和PD-L1 表達情況，然而不同腫瘤細胞中PD-1 和PDL1 陽性表達不盡相同。因此，選擇一種合適的評估方法測定免疫位點陽性率表達的一致性具有重要意義。研究［13］指出，RNAscope 原位雜交法是在原位雜交技術基礎上檢測特定基因mRNA 水平的檢測技術，檢測基因的mRNA 能夠替代檢測蛋白質。被檢測基因的空間改變為診斷與預后提供了重要信息，尤其是在免疫腫瘤學中，免疫活性狀態、細胞浸潤、表型等可能與患者的生存時間密切相關。RNAscope 原位雜交法為一種全自動檢測方法，可檢測多個樣本的RNA 水平，可定量檢測特定RNA的表達，并能夠避免主觀性因素造成的誤差，相較于免疫組化法，RNAscope 原位雜交法具有更高的靈敏度與特異度，但其成本較高［14］。

既往研究［15］結果顯示，PD-1 和PD-L1 在宮頸癌組織中表達水平較高。本研究結果顯示，免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測PD-1、PD-L1 表達一致性良好，考慮單純采用免疫組化法測定PD-1、PD-L1 表達存在一定的偏差，因此采用RNAscope原位雜交法檢測PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達水平。后續可采用免疫組化法聯合RNAscope 原位雜交法檢測免疫位點配體。已有研究［16］證實，RNAscope 原位雜交法適用于檢測非小細胞肺癌組織中PD-1、PD-L1 表達，且與免疫組化法具有良好的一致性。本研究結果顯示，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達與患者年齡、脈管侵犯、淋巴結轉移、神經侵犯、TNM 分期、腫瘤直徑無關。有研究［17］指出，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達與進展期胃癌患者腫瘤分化、性別、轉移、年齡無關。國內有研究［18］表明，相較于PD-L1mRNA 陰性表達的胃癌患者，PDL1mRNA 陽性表達的患者總生存時間延長，而PD-1mRNA 表達與胃癌患者總生存時間無關。本研究進一步分析PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達對患者總生存時間的影響，結果顯示，PD-1mRNA 陽性表達與PD-1mRNA 陰性表達的總生存曲線比較差異無統計學意義；PD-L1mRNA 陽性表達與PDL1mRNA 陰性表達的總生存曲線比較差異無統計學意義。提示PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達與宮頸鱗狀細胞癌患者總生存時間無關。

免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測宮頸鱗狀細胞癌組織中PD-1 和PD-L1 表達一致性良好，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達與患者總生存時間無關，后續可聯合2 種檢測方法檢測宮頸鱗狀細胞癌特異性免疫位點。