PI3Ks 新型抑制劑NVP-BEZ235 對食管鱗癌的抑制作用*

姚佳儀，王斯琦，錢玉蘭，孫曉鳴，馬 賽，楊 薇，郭 冰，楊 中，查良英

（1. 蘇州大學附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215006； 2. 江蘇省蘇州市第五人民醫院，江蘇 蘇州 215131；3. 江蘇省蘇州市廣濟醫院，江蘇 蘇州 215131； 4. 南京醫科大學附屬蘇州醫院，江蘇 蘇州 215008；5. 江蘇省蘇州高新區人民醫院，江蘇 蘇州 215129）

食管癌是人類常見的惡性腫瘤，我國發病率和病死率分別居全球第6位和第4位，嚴重威脅國民健康［1］。食管癌在組織病理學上主要分為食管鱗狀細胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）［2］，我國以食管鱗癌為主，占食管癌的90%。目前，食管鱗癌的發病機制尚不完全清楚，其治療仍以手術為主，輔以放射治療和化學治療，臨床缺乏有效的分子靶向藥物，患者5年生存率極低［3］。因此，探索新的靶向治療藥物對食管鱗癌的治療十分重要。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）是一種位于胞內的磷脂酰肌醇激酶家族，在細胞的增殖、分化和胞內運輸中具有關鍵作用［4-5］。PI3Ks 根據其編碼基因和催化底物，可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3 種類型。Ⅰ類亞型的PI3Ks 為異源二聚體，由1 個110 000 催化亞單位（p110α，由位于3q26.3 的PIK3CA 編 碼）和1 個85 000 調 節 亞 單 位（p85α，由位于5q13.1 的PIK3R1 編碼）組成［6］。PIK3CA在食管鱗癌中存在高頻突變和擴增，其表達與淋巴結轉移相關［7-8］。磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基p85α抗體（PI3K-p85α）的基因多態性與食管鱗癌的風險增加有關［9］。有研究指出，lncRNA LINC01503 可誘導PI3K -p85α 的激活而促進食管鱗癌細胞的增殖［10］。NVP -BEZ235（Dactolisib）是一種新型的PI3Ks 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）雙重抑制劑，對肝癌、甲狀腺癌等均顯示出良好的抑制作用［11-12］。本研究中主要通過體內外模型探討了NVP-BEZ235 對食管鱗癌的作用，以及PI3K -p85α 表達水平對NVP-BEZ235 效果的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、動物與細胞

儀器：Thermo 240 型CO2培養箱，Thermo Varieskan LUX 型酶標儀，均購自（美國Thermo Revco 公司；Olympus Ⅸ51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：RPMI 1640 培養基（美國Gibco 公司，批號8122282）；胎牛血清（法國Biowest公司，批號為S1700）；NVP - BEZ235（Dactolisib，Med Chem Express 公司，批號20210712）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號為HY -15925），二甲基亞砜（批號HY - Y0320），均購自Med Chem Express 公司；吉姆薩染液（北京索萊寶科技有限公司，批號為G1015）；PI3K-p85α（批號為60225-1-Ig），甘油醛- 3 - 磷酸脫氫酶抗體（GAPDH，批號60004 -1 - Ig），均購自美國Proteintech 公司；BCA 檢測試劑盒（批號為P0012S），0.25%胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸（Trypsin - EDTA，批號為C0201），放射免疫沉淀分析裂解液（RIPA，批號為P0013B），上樣緩沖液（Loading Buffer，批號為P0015），聚偏二氟乙烯膜（PVDF，批號為FFP28），脫脂牛奶（批號為P0216），均購自上海碧云天生物科技有限公司；發光液（蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司，批號為180-5001）。

動物：6 周齡雌性BALB/c-nu 裸鼠10 只，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，生產許可證號SCXK（浙）2019 - 0004，使用許可證號SCXK（蘇）2022 -0008。動物實驗經江蘇省蘇州市第五人民醫院倫理委員會批準［批件號為（2022）院倫理審字（10）號］。飼養條件為，SPF 級動物房，溫度23～25 ℃，相對濕度（50±10）%，12 h/12 h 明暗交替。

細胞：食管鱗癌細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE510、KYSE410、 TE1、 KYSE150、 KYSE180、 KYSE270、KYSE450 均購自中國科學院細胞庫；食管腺癌細胞系OE33、OE19、ESO26 由美國南加州大學De-chenLin 教授惠贈。

1.2 方法

細胞培養：在37 ℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的1640培養基培養食管癌細胞系，隔天換液。每個細胞系給予0，1，4，8，16，32，64，128 nmol/L 濃度梯度的NVP-BEZ235培養48 h。

細胞增殖能力檢測：采用MTT 比色法。取對數生長期細胞，接種于96 孔板中，每孔6 × 103個，在37 ℃、5% CO2條件下培養。每個細胞系給予0，1，4，8，16，32，64，128 nmol/L NVP-BEZ235 培養48 h。加入MTT（每孔20 μL），繼續培養4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO，每孔200 μL）振蕩10 min。以酶標儀于570 nm波長處測定吸光度（OD），平行測定3 次，并計算細胞生存率。細胞生存率（%）=OD用藥組/OD對照組× 100%。以增殖率為50%時的藥物濃度為半數抑制濃度（IC50）。

細胞集落形成實驗：取對數生長期細胞，接種于24孔板中，每孔1×103個，在37 ℃、5%CO2條件下培養4 d。當培養皿中出現肉眼可見克隆時，給予10 nmol/ L NVP-BEZ235培養48 h。棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）小心浸洗2 次，空氣干燥。甲醇固定15 min，棄甲醇，空氣干燥。用吉姆薩染液染色10 min，用流水緩慢洗去染液，空氣干燥。

細胞表達檢測：采用免疫印跡（Western blot）法。在T25瓶中收集腫瘤細胞，計數2×106細胞，離心（轉速為1 500 r/min）5 min，加入300 μL RIPA 裂解液，4 ℃冰浴10 min，超聲5 min，離心（轉速為12 000 r/min）10 min，采用BCA 法測定蛋白質濃度，加入Loading Buffer 煮沸5 min。冷卻后上樣（30 μg蛋白/泳道）。100 V、60 min進行轉膜，將膠上的蛋白轉移到PVDF 膜上，并在室溫條件下用牛奶封閉1 h，加入p85α 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；次日用TBST 洗脫3 次，每次15 min；加入二抗孵育1 h。加入顯影檢測試劑與膜蛋白充分混勻，室溫孵育5 min，用凝膠成像儀曝光并拍照。

裸鼠移植瘤實驗：6周齡雌性BALB/c-nu裸鼠10只，KYSE30 腫瘤細胞1×106個/只接種于裸鼠上肢腋下。每10 d 測量皮下移植瘤的長度和寬度，計算腫瘤體積，體積= 1/ 3 ×（長度× 寬度× 寬度）。待腫瘤體積達到100 mm3時，將裸鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5 只。實驗組腹腔注射NVP-BEZ235（10 mg/kg），每周2 次；對照組注射PBS。第50 天使用CO2法處死小鼠，剝取腫瘤組織，稱定質量并拍照。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌細胞系中PI3K-p85α 表達

食管鱗癌細胞系中KYSE30，KYSE70，KYSE510，KYSE410，TE1，以及食管腺癌細胞系OE33 和OE19 中PI3K - p85α 表達均較高；食管鱗癌細胞系KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450，以及食管腺癌細胞系ESO26中PI3K-p85α的表達量較低。詳見圖1。

圖1 食管鱗癌細胞系中PI3K-p85α表達量Fig.1 Expression of PI3K-p85α in ESCC cell lines

2.2 對食管鱗癌細胞系增殖能力的影響及IC50

結果顯示，高濃度處理后，細胞的增殖能力均顯著下降，每個細胞系IC50差異顯著。PI3K-p85α 高表達的食管鱗癌細胞系對NVP-BEZ235 的敏感度更高，抑制效果較好，KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1的IC50分別為4.92，5.43，4.76，7.78 nmol/L；PI3K - p85α 表達量較低的食管鱗癌細胞系對NVP-BEZ235的敏感度低，抑制效果較差，KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450的IC50分別為13.21，18.44，20.37，48.45 nmol/L。詳見表1。由圖2 可知，在加入10 nmol/ L NVP - BEZ235 處理的細胞集落形成實驗中，KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1 的集落數目少于KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450的集落數目。

圖2 NVP-BE235對食管鱗癌細胞系IC50及集落形成的影響A.IC50 values of ESCC cell lines exposed to different concentrations of NVP -BEZ235 B.Colony formation assay of ESCC cell lines treated with 10 nmol/L of NVP-BEZ235Fig.2 Effect of NVP-BEZ235 on IC50 values and colony formation of ESCC cell lines

表1 NVP-BEZ235對食管癌細胞系細胞增殖的影響（±s，n=4）Tab.1 Effect of NVP-BEZ235 on cell proliferation of ESCC cell lines（±s，n=4）

注：與0 nmol/L比較，*P ＜0.05。Note：Compared with those at 0 nmol/L，*P ＜0.05.

序號1 2 3 4 5 6 7 8濃度（nmol/L）0 1 4 8 16 32 64 128 KYSE30 100.00±10.23 95.13±10.34 70.15±7.45*11.01±6.12*9.92±7.34*3.56±3.32*2.63±2.28*1.86±1.23*KYSE150 100.00±10.34 80.83±8.78*68.05±7.45*64.46±7.64*54.50±5.12*34.34±3.37*15.34±1.76*7.64±0.89*KYSE70 100.00±12.12 86.76±8.56 62.60±6.79*32.12±3.42*23.78±3.87*17.98±1.84*9.67±0.75*4.32±0.43*KYSE510 100.00±9.79 88.37±8.87 52.90±5.67*34.06±3.47*19.41±2.01*16.77±1.72*11.02±1.23*7.25±0.82*TE1 100.00±9.01 91.55±9.13 72.88±7.45*43.32±4.56*31.87±3.41*15.91±1.52*9.96±0.98*5.50±0.45*KYSE180 100.00±9.87 98.64±9.65 75.71±8.03*69.22±7.12*54.55±6.34*38.38±4.12*22.14±2.78*15.09±1.68*KYSE270 100.00±10.21 90.94±9.42 88.86±8.91 74.46±7.82*55.72±5.71*35.23±3.52*22.92±3.91*14.87±1.52*KYSE450 100.00±11.39 94.36±9.21 88.67±8.38*81.15±8.31*74.24±7.31*65.54±6.73*48.74±5.01*19.14±2.13*

2.3 對食管鱗癌細胞系裸鼠皮下移植瘤生長能力的影響

腹腔注射NVP-BEZ235的荷瘤裸鼠皮下移植瘤見圖3 A。實驗組的移植瘤體積為（531.98±37.14）mm3，顯著低于對照組的（1 169.5 ± 110.34）mm3（t= 12.24，P＜0.001）。實驗組的移植瘤質量為（0.37±0.10）g，顯著低于對照組的（0.91±0.08）g（t=9.51，P＜0.001）。詳見圖3 B和圖3 C。

3 討論

我國是食管鱗癌的高負擔國家，過量飲酒、吸煙等對食管造成損傷的各類慢性刺激及環境因素是中國食管鱗癌發病的主要原因［13-14］。過去幾十年，不同于肺癌等其他腫瘤，食管鱗癌在靶向治療方面發展緩慢，5年生存率改善程度低，亟需在食管鱗癌治療靶點發現和抑制劑探索方面進行深入研究［3，15］。

腫瘤靶向藥物主要是利用腫瘤細胞與正常細胞間分子生物學上的差異（癌基因的突變激活或異常高表達）而抑制腫瘤細胞生長，促進其凋亡壞死，同時降低對正常組織的損害［16］。NVP - BEZ235 是一種 新 型PI3K /mTOR 雙重抑制劑，其化學成分是咪唑并喹啉類的小分子合成物，NVP-BEZ235 可與PI3K 和mTOR 激酶的ATP結合口袋結合，抑制其激酶活性［17］。有研究表明，NVP-BEZ235在非小細胞肺癌、乳腺癌、肝癌、多發性骨髓瘤、胰腺癌、膠質母細胞瘤等腫瘤中均能產生有效的抗腫瘤活性［12，17-19］。NVP-BEZ235 可誘導p21 基因表達而阻滯細胞周期［20］。NVP-BEZ235 還可通過抑制mTORSer2448位點的去磷酸化下調mTOR 的活性，進而抑制AKTSer473位點磷酸化，最終誘導細胞凋亡［18，21］。本研究中探討了NVP - BEZ235 對食管鱗癌細胞系的抑制作用，結果發現4 nmol/L NVP-BEZ235便可對腫瘤細胞產生明顯抑制，提示NVP-BEZ235 對食管鱗癌的細胞增殖抑制效果良好。

Ⅰ型PI3K分為ⅠA型（p110α，p110β，p110γ）和ⅠB型（p110δ），其中由p110α 和p85α 組成的ⅠA 類PI3K 是目前研究最廣泛的類型，主要參與細胞生長、胰島素信號轉導和葡萄糖代謝［5］。p85α 由5 個結構域構成。SH3（Src homology 3 domain）結構域、GAP 結構域（a Rac binding domain flanked by two proline - rich domains，nPRD and cPRD）、N- 端SH2（nSH2）結構域、SH2間（iSH2）結構域和C-端SH2（cSH2）結構域組成。p85α 的主要功能是穩定和結合抑制p110α。p85α 的iSH2結構域與p110α 的結合對p110α 的蛋白穩定性十分重要。但當細胞受到胞外刺激時，nSH2與cSH2結構域可和酪氨酸激酶受體及接頭蛋白中磷酸化的酪氨酸結合，破壞iSH2結構域對p110α 的接觸抑制，從而促進p110α 催化亞基的激活，最終引起PI3K激酶活化［22-24］。據報道，通過免疫組織化學技術檢測了590 例石蠟包埋的食管鱗癌腫瘤組織中PI3K-p85α 蛋白的表達，發現57.1%的腫瘤組織高表達PI3K-p85α，且PI3K-p85α的高表達與不良預后顯著相關［25］。本研究結果表明，PI3K -p85α 的高表達可顯著提高NVP - BEZ235 對食管鱗癌細胞的抑制作用。在食管鱗癌細胞系KYSE30，KYSE70，KYSE510，TE1 中，10 nmol/ L NVP - BEZ235具有明顯的抑制作用。而PI3K-p85α 相對低表達的食管鱗癌細胞系KYSE150，KYSE180，KYSE270，KYSE450對NVP-BEZ235 的敏感度較低。裸鼠移植瘤實驗結果表明，腹腔注射較低劑量（10 mg/kg）的NVP-BEZ235促使移植瘤體積明顯縮小，表明NVP-BEZ235 對食管鱗癌體內模型的療效較好。

綜上所述，較低劑量（10 mg/kg）NVP-BEZ235 可在細胞系模型和裸鼠皮下移植瘤中抑制食管鱗癌細胞的增殖，且PI3K - p85α 高表達可顯著增強NVP -BEZ235對食管鱗癌細胞的抑制作用。