正交試驗優選十棗湯的提取工藝*

洪 博，劉 軍，林 宇，劉哲丞，劉榮宏，李文靜

（齊齊哈爾醫學院藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

肝硬化腹腔積液俗稱肝腹水，是由于肝細胞變性、壞死、再生，促使纖維組織增生和瘢痕收縮，致使肝臟質地變硬形成肝硬化，引起門靜脈高壓、肝功能損害，導致腹水生成。約67.3%的住院肝硬化患者伴有肝腹水，其5年病死率高達44%［1-2］。目前，肝腹水的治療主要為利尿、低鈉、補充白蛋白等，但存在電解質紊亂、誘發肝性腦病、頑固性腹水等問題［3］。中醫中藥治療肝腹水具有獨特優勢，多從肝脾腎論治，注重調節與恢復氣血水的功能［4-5］。十棗湯始載于東漢張仲景的《傷寒雜病論》，為瀉下劑，具有攻逐水飲之功效［6-7］，主治懸飲，咳唾胸脅引痛，臨床常用于治療滲出性腦膜炎、結核性胸膜炎、肝硬化、慢性腎炎所致的胸腔積液、腹水或全身水腫，以及晚期血吸蟲病所致腹水等屬水飲內停里實證者［8］。由芫花、甘遂、大戟、大棗組方，為峻下逐水之藥，以大戟二烯醇為代表的四環三萜類化合物為其主要特征性活性成分，具有抗肝腹水、抗炎、降血壓等作用［9］。方中芫花辛溫有毒、善消胸脅之水［10-11］，甘遂苦寒有毒、善行經隧水濕［12-13］，大戟苦寒有毒、善瀉六府之水［14-15］，共為君藥；大棗補中益氣、扶正，養心安神，能緩和多種猛烈中藥的毒性［16］，為佐使藥。本研究中以大戟二烯醇含量和干膏得率的綜合評分為評價指標，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗對十棗湯提取工藝中的加水量、提取時間、提取次數進行考察，優選十棗湯的提取工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU LC-30AD 型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；ME155DU 型精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.01 mg）；SCT型數顯攪拌電熱套（菏澤市精科儀器有限公司）。

1.2 試藥

大戟（批號為20210324），芫花（批號為20210427），甘遂（批號為20210612），大棗（批號為20210728），均購自齊齊哈爾市鑫金龍中藥房（景新街店），經齊齊哈爾醫學院藥學院郭麗娜教授鑒定分別為大戟的干燥根、芫花的干燥花蕾、甘遂的干燥塊根和大棗的成熟果實，均符合2020年版《中國藥典（一部）》中相關規定；大戟二烯醇對照品（信陽市中檢計量生物科技有限公司，批號為D06711809002，含量為99.0%）；十棗湯（實驗室自制，批 號 分 別 為20220101，20220102，20220103，20220104，20220105，20220106，20220107，20220108，20220109，20220110）；甲醇、乙腈（色譜純，美國天地有限公司）；蒸餾水（屈臣氏集團）；甲酸（色譜純，北京迪馬科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 大戟二烯醇含量測定

2.1.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Waters T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（90∶10，V/V）；流速：0.3 mL/ min；檢測波長：254 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。供試品溶液色譜中，大戟二烯醇色譜峰與最近組分的分離度大于1.5，理論板數按大戟二烯醇峰計應不低于4 500，拖尾因子0.95～1.05。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.EuphadienolA.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.1.2 溶液制備

取大戟二烯醇對照品8.02 mg，精密稱定，加甲醇溶解，定容于10 mL 容量瓶中，即得對照品溶液。取芫花、甘遂、大戟、大棗各3.00 g，精密稱定，加100 mL 蒸餾水冷凝回流煎煮30 min，去渣，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得十棗湯水提液，作為供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取對照品溶液適量，加甲醇稀釋成質量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/mL的系列標準溶液，吸取上述標準溶液各10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。以大戟二烯醇質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=4 102.2X-7 636.5（r=0.999 6，n= 7）。結果表明，大戟二烯醇質量濃度在6.25～400 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：選擇線性關系考察項下最小質量濃度的樣品稀釋10 倍為方法的定量限，結果為0.625 μg/ mL；稀釋3 倍為方法的檢測限，結果為0.208 μg/mL。

精密度試驗：分別精密吸取質量濃度為6.25，25，100 μg/mL 的對照品溶液各10 μL，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結果低、中、高質量濃度大戟二烯醇色譜峰面積的RSD分別為1.12%，0.70%，1.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20220110）樣品適量，共6 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果大戟二烯醇含量的RSD為1.29%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：分別取芫花、甘遂、大戟、大棗各3.00 g，精密稱定，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為1.46%（n= 7），表明樣品在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的供試品溶液9 份，分為低、中、高3 組，各3 份，分別加入相當于樣品中大戟二烯醇含量50%，100%，150%的對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結果平均加樣回收率為100.11%，RSD為1.84%（n=9）。

2.1.4 含量測定

分別取芫花、甘遂、大戟、大棗各3.00 g，精密稱定，平行3 份，按2.1.2 項下方法分別制備供試品溶液和對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量。結果3批樣品中大戟二烯醇的含量分別為0.95，0.98，1.04 mg/g。

2.2 干膏得率測定

精密量取供試品溶液10 mL，置已干燥至恒重的潔凈蒸發皿中，水浴蒸干，105 ℃烘箱中干燥4 h 后取出，放入干燥器冷卻，稱定質量，計算干膏得率。干膏得率（%）=干膏質量/藥材質量×100%。

2.3 單因素試驗

查閱文獻［17-18］并結合預試驗，以提取時間（因素A）、加水量（因素B）和提取次數（因素C）為影響因素進行單因素試驗，分別考察上述3種因素對大戟二烯醇含量和干膏得率綜合評分的影響。綜合評分=（Xi/Xmax×0.8+Yi/Ymax×0.2）×100［17］。其中，Xi為當次大戟二烯醇含量，Xmax為大戟二烯醇含量最大值，Yi為當次干膏得率，Ymax為干膏得率最大值。詳見表1。

表1 單因素變化條件Tab.1 Conditions of the single factor test

提取時間［17］：當提取時間從0.5 h升至1.5 h時，綜合評分逐漸升高；超過1.5 h后，隨著時間的延長，綜合評分逐漸下降（圖2 A）。故選擇1.0，1.5，2.0 h進行考察。

加水量：當加水量從8 倍升至12 倍時，綜合評分逐漸升高；升至16 倍時，綜合評分下降（圖2 B）。故選擇10，12，14倍進行考察。

圖2 單因素試驗結果A.Extraction time B.Water addition C.Extraction timesFig.2 Results of the single factor test

提取次數：提取2次時綜合評分最高（圖2 C），但考慮提取時間和溶劑用量，選擇1，2，3次進行考察。

2.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，采用L9（34）正交試驗進行考察，因素與水平見表2。以大戟二烯醇含量及干膏得率的綜合評分為評價指標，采用SPSS 16.0 統計學軟件對十棗湯的提取工藝進行分析。正交試驗設計與結果見表3。由表4可知，3個因素對提取工藝的影響大小依次為C ＞A ＞B；由表3 可知，最佳提取工藝為C2A2B1。方差分析結果表明，因素A 和因素C 對結果均有顯著影響（P＜0.05），因素B 對結果無顯著影響（P＞0.05），故優選的最佳提取工藝為提取2 次，提取時間為1.5 h，加入10倍量水。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and levels

表3 正交試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of the ANOVA

2.5 驗證試驗

按處方量稱取芫花、甘遂、大戟、大棗，平行制備5份樣品，按最佳提取工藝提取，測得大戟二烯醇的平均含量為0.99 mg/ g，RSD為1.24%（n= 5）；平均干膏得率為44.01%，RSD為1.64%（n= 5）。結果表明，該優選工藝合理，提取方法可行。

3 討論

中藥湯劑的質量直接影響其臨床療效，正交試驗設計是目前應用廣泛的優選提取工藝的方法，尤其是在進行工業大生產前，優良的提取工藝可節省大量的財力和人力。我國從20世紀90年代就引入了煎藥機，這種大批量生產湯劑的方式不僅節約時間，還能保證在最佳提取工藝條件下提取較高含量的有效成分。本研究中優選了提取次數、提取時間及加水量3個因素，并對其結論進行了驗證，為十棗湯提取工藝參數的選擇提供了科學依據。本研究中的待測成分為大戟二烯醇，來源于本方中的甘遂和大戟，是十棗湯治療水腫脹滿、胸腔積液、腹水、二便不利的主要活性成分。在實際測定中，由于大戟二烯醇的極性較小，采用高效液相色譜法測定時，出峰時間較長，流動相稍調整會導致出峰時間的大幅變動，同時考慮樣品中其他成分的干擾，最終確定以乙腈-0.1%甲酸水溶液（90∶10，V/V）為流動相進行分離。

綜上所述，本研究中優選的十棗湯的最佳提取工藝為提取2 次，提取時間為1.5 h，加入10 倍量水，經驗證工藝合理、可行。