天麻素抗偏頭痛作用機制的網絡藥理學與分子對接研究*

楊 杰，郭步伐，龍 盼，李 沙

（畢節醫學高等專科學校基礎醫學系，貴州 畢節 551700）

天麻素是天麻的主要有效成分，是天麻質量控制的指標性化合物，具有鎮痛鎮靜、抗驚厥、神經保護、改善學習記憶、降壓、抗凝、抗血小板聚集等藥理作用［1-2］。這與天麻祛風通絡、平抑肝陽、息風止痙的功效密不可分，臨床可用于治療偏頭痛。回顧經典的中醫古方，治療偏頭痛頻次達50 次以上的中藥為川芎、白芍、天麻、當歸、白芷和甘草，故天麻主要成分天麻素治療偏頭痛的臨床價值值得進一步挖掘［3］。網絡藥理學是系統生物學的一門分支學科，可從整體觀角度闡釋中藥及中藥復方治療疾病的關鍵分子通路［4-7］。本研究中以天麻主要有效成分單體天麻素為核心展開研究，遵循《網絡藥理學評價方法指南》［8］，在天麻素治療偏頭痛療效確切的基礎上，通過網絡藥理學與分子對接技術篩選天麻素抗偏頭痛的關鍵分子通路及關鍵靶點，為臨床應用提供分子機制基礎。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 網絡藥理學研究

收集天麻素抗偏頭痛靶點：在TCMSP 數據庫（https：// old. tcmsp. e. com/ index. php）中獲取天麻素的化學結構；在SwissTargetPrediction 數據庫（https：//www.SwissTargetPrediction.cn/）中選擇的物種為“人”，獲取天麻素的作用靶點，以靶基因的縮寫表示；在GeneCards數據庫（https：// www. genecards. org/）中以“migraine”為關鍵詞搜索偏頭痛相關靶點，通過R 3.6.2 軟件繪制維恩圖，取天麻素靶點與偏頭痛相關靶點的交集，即得天麻素抗偏頭痛共有靶點。

構建蛋白互作（PPI）網絡（天麻素抗偏頭痛靶點網絡）：將分析得到的天麻素抗偏頭痛靶點導入String 數據庫（https：// www. string - db. org/），選擇物種為“人”，輸出天麻素抗偏頭痛靶點網絡圖，保存.tsv 格式文件，并輸入R 3.6.2 軟件，進行條形圖分析，并計算網絡中節點自由度值，揭示其核心靶點。

GO 生物過程富集分析與KEGG 通路富集分析及靶點- 通路網絡：通過R 3.6.2 軟件，將天麻素抗偏頭痛靶點基因的縮寫轉換為基因ID，經R 3.6.2 軟件進行GO 生物過程富集分析與KEGG 通路富集分析，篩選富集P值較顯著的信號通路，并用條形圖表示。從上述分析中篩選出富集顯著的20 條信號通路與30 個靶點，經Cytoscape 3.9.1 軟件構建靶點- 通路網絡，體現天麻素治療偏頭痛多靶點、多途徑的整體效應。

1.2 分子對接驗證

經PPI 網絡與靶點- 通路網絡共同顯示天麻素抗偏頭痛核心靶點，并進行天麻素與核心靶點的分子對接驗證，其操作過程如下。1）經Chem3D 軟件，將天麻素2D 結構（. sdf 格式文件）轉化為3D 結構（. mol2 格式文件）；2）在PDB 數據庫（http：// www. rcsb. org/）中下載靶點3D結構（.pdb格式文件），并經PyMOL 軟件去除水分子和小分子配體；3）在AutoDockTools 1.5.6 軟件中導入靶點的3D 結構，輸出. pdbqt 格式文件，輸入天麻素.mol2 格式文件，導出天麻素.pdbqt 格式文件，運行Grid 模塊，設置天麻素與靶點對接的活性口袋；4）運行AutoDock_vina 1.1.2 分子模擬軟件進行分子對接，用結合能評價化合物與受體的匹配情況，用PyMOL 軟件繪制最佳匹配結果圖。

2 結果

2.1 天麻素抗偏頭痛靶點

在GeneCards 數據庫中以關鍵詞“migraine”搜索到偏頭痛相關靶點3 081 個，并與103 個天麻素作用靶點取交集，得到天麻素抗偏頭痛共有靶點50個。詳見圖1。

圖1 天麻素與偏頭痛共有靶點的維恩圖Fig.1 Venn diagram of common targets of gastrodin and migraine

2.2 構建天麻素抗偏頭痛靶點的PPI 網絡

將50個共有靶點輸入String數據庫，得到天麻素抗偏頭痛靶點的PPI 網絡，提示靶點與靶點的相互作用。靶點相互作用的節點數越多，自由度值越高，表明該靶點在此網絡中所處核心地位就越高。自由度值排前30的靶點的PPI網絡條形圖見圖2。

圖2 天麻素抗偏頭痛靶點的PPI網絡條形圖Fig.2 PPI network histogram of targets related to gastrodin against migraine

2.3 GO 生物過程富集、KEGG 通路富集及靶點- 通路網絡構建

GO 生物過程富集分析顯示（圖3），富集P值較顯著的生物過程為內肽酶活性、碳酸鹽脫水酶活性、水裂解酶活性、碳氧裂解酶活性、裂解酶活性、金屬內肽酶活性、涉及細胞凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性、胰島素受體底物結合、胰島素樣生長因子Ⅰ結合、寡聚糖，結合的富集靶點數量分別為10個、8個、8個、8個、8個、5 個、4 個、3 個、3 個、3 個。進一步對50 個天麻素抗偏頭痛靶點進行KEGG 通路富集分析（圖4），結果顯示，富集P值較顯著的信號通路為氮代謝信號通路和脂質與動脈粥樣硬化，富集靶點數量分別為8 個、12 個。這2 條信號通路富集的靶點基因數量為20 個，占天麻素抗偏頭痛靶點數量的40.00%，可被認為是天麻素治療偏頭痛的關鍵分子通路。

圖3 天麻素抗偏頭痛靶點的GO生物過程富集分析條形圖Note：Red refers to the biological process with more significant enrichment P-values.Fig.3 Bar chart of GO biological process enrichment of targets related to gastrodin against migraine

圖4 天麻素抗偏頭痛靶點的KEGG通路富集分析條形圖Note：Red refers to the signaling pathway with more significant enrichment P-values.Fig.4 Bar chart of KEGG pathway enrichment of targets related to gastrodin against migraine

基于富集P值較顯著的2 條信號通路，氮代謝信號通路富集的靶點基因為不同亞型的碳酸酐酶（CA），脂質與動脈粥樣硬化信號通路富集的靶點基因主要包含如下3個方面。1）基質金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-9、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（CASP）1、CASP3、CASP8、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）等損傷、細胞凋亡相關靶基因；2）E - 選擇素（SELE）、P - 選擇素（SELP）等單核細胞激活相關靶基因；3）PI3K、糖原合酶激酶-3β（GSK3β）等細胞增殖過程相關靶基因。

通過Cytoscape軟件將富集顯著的20條KEGG 信號通路與30個靶點構建為靶點-通路網絡（圖5），結果顯示，每條通路平均與6.15個靶點產生交互作用，每個靶點平均與3.84 條信號通路產生交互作用，體現了中藥成分治療疾病的多靶點、多途徑效應，與中醫學的整體觀念不謀而合。

圖5 天麻素抗偏頭痛靶點-通路網絡圖Fig.5 Network of targets-pathway related to gastrodin against migraine

2.4 分子對接結果

將氮代謝、脂質與動脈粥樣硬化等KEGG信號通路富集的20個靶點基因與PPI網絡條形圖中顯示的30個靶點基因相對應，取重疊的14 個靶點基因與天麻素進行分子對接驗證。以分子對接結合能的絕對值作為評價對接驗證結果的指標，當分子對接結合能絕對值高于7 kcal/mol時，表明結合能力高。同時，采用臨床治療偏頭痛的常見藥物氟桂利嗪進行對照。結果天麻素與偏頭痛相應靶點對接結合能絕對值均低于氟桂利嗪與偏頭痛靶點對接結合能絕對值，天麻素與CA1，CA9，MMP - 9，CASP1 靶點的對接結合能絕對值高于7.5 kcal/mol。結果見表1。天麻素、氟桂利嗪與CA1 和CA9靶點的分子對接模擬圖見圖6。

圖6 天麻素、氟桂利嗪與CA1和CA9的分子對接模擬圖A.Docking of flunarizine with CA1 B.Docking of flunarizine with CA9 C.Docking of gastrodin with CA1 D.Docking of gastrodin with CA9Fig.6 Molecular docking simulation graph of gastrodin and fluranazine with CA1 and CA9

表1 天麻素、氟桂利嗪與相應偏頭痛靶點基因的分子對接結果Tab.1 Molecular docking results of gastrodin，flunarizine and corresponding migraine targets-related genes

3 討論

偏頭痛是一種周期性反復發作、纏綿難愈的頭痛疾病，疼痛發作時難以忍受，嚴重影響患者的日常生活。目前，其治療以鈣通道阻滯劑（氟桂利嗪或尼莫地平）為核心，聯用天麻素的臨床總有效率達90%以上［9-10］。天麻素通過多靶點、多途徑治療偏頭痛。首先，天麻素及其衍生物通過抑制三叉神經激活，進而抑制三叉神經節及三叉神經脊束尾側核血清降鈣素基因相關肽的釋放，降低一氧化氮（NO）、內皮素-1 等血管活性因子的表達水平，既可調節血管功能，也可通過降低血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素1β、白細胞介素18等炎性因子水平而抑制神經源性炎性反應［11-17］。其次，天麻素通過降低氧化型低密度脂蛋白水平，改善偏頭痛患者氧化應激水平，防止線粒體氧化應激損傷，減少凋亡小體的產生，從而下調細胞凋亡基因CASP 的表達［18］。最后，神經遞質傳遞異常是偏頭痛發生的主要機制之一，如5-羥色胺是偏頭痛發作時神經功能異常的主要神經遞質，天麻素通過升高血清5-羥色胺水平而改善神經功能紊亂［18］。

研究表明，偏頭痛患者血清中MMP-9表達水平會明顯升高［19-20］。CASP1涉及細胞凋亡過程，也可觸發炎癥［21-22］，為偏頭痛神經源性炎癥標志物。CA表達上調，可參與細胞遷移、CO2/NO 穩態與信號轉導及偏頭痛患者神經功能異常、神經源性炎癥、血管功能異常等密切相關［14，23］。由圖4可知，天麻素抗偏頭痛靶點富集較顯著的2條信號通路為氮代謝和脂質與動脈粥樣硬化。由表1可知，上述信號通路直接相關的基因為CA1，CA9，CASP1，MMP-9等。分子對接結果顯示，天麻素與上述基因的分子對接結合能絕對值均高于7.5 kcal/mol，對接良好，表明上述基因可成為天麻素抗偏頭痛的主要靶點。

綜上所述，天麻素可能通過調控氮代謝和脂質與動脈粥樣硬化信號通路，影響CA，MMP，CASP 等靶點基因的表達，從而治療偏頭痛，但其具體作用機制有待后續實驗證實。