超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間-質(zhì)譜法鑒定舒肝散成分*

劉曉俊，張 娥，董麗榮，楊汝琪，趙艷麗

（1. 云南省昆明市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明 650200； 2. 昆明學(xué)院，云南 昆明 650214； 3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200）

舒肝散由當(dāng)歸、白芍、柴胡、香附、白術(shù)、茯苓、梔子、牡丹皮、薄荷、甘草10 味藥材組方，具有舒肝理氣、散郁調(diào)經(jīng)功效，可用于肝氣不舒的兩肋疼痛、胸腹脹悶、月經(jīng)不調(diào)、頭痛目眩、心煩意亂、口苦咽干，以及肝郁氣滯所致面部黃褐斑［1-2］。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，其有效成分較模糊，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，難以保證臨床安全、有效使用［3］。舒肝散現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)WS-10158（ZD-0158）-2002《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 舒肝散》僅以薄層色譜法對(duì)其中的當(dāng)歸、香附、白術(shù)進(jìn)行鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定梔子苷的含量。近年來(lái)，超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間-質(zhì)譜（UHPLCQ - TOF - MS）法被廣泛用于代謝組學(xué)研究［4-5］。本研究中采用UHPLC - Q - TOF - MS 法分析舒肝散中多種成分，獲得多級(jí)碎片離子，參考文獻(xiàn)［6 - 11］和數(shù)據(jù)庫(kù)信息，分析特征化合物的精準(zhǔn)分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)、化合物的裂解方式等，從而快速、準(zhǔn)確地鑒定出舒肝散的有效成分，進(jìn)一步闡明了該復(fù)方制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，為提高舒肝散制劑質(zhì)量提供了參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

X500R QTOF 型高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司）；LC30AD型超高效液相色譜儀（日本島津公司），配有島津lc30ad 型超高效液相色譜系統(tǒng)；Chorus LC216-LC134 型超純水制備儀（威立雅水處理技術(shù)有限公司）；AL104 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為萬(wàn)分之一）；SONOREX RX255 型超聲波清洗儀（德國(guó)Bandelin公司，功率為640 W，頻率為35 kHz）。

1.2 試藥

舒肝散（昆明中藥廠有限公司，編號(hào)為S1-S3）；甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC - C18柱（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min 時(shí)90%A，3～15 min 時(shí)90%A →30%A，15～18 min 時(shí)30%A →10%A，18～19 min 時(shí)10%A →90%A，19～23 min 時(shí)90%A）；流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電離源：電噴霧電離（ESI）源；霧化氣壓力：0.379 MPa；輔助氣壓力：0.379 MPa；氣簾氣壓力：0.241 MPa；霧化器溫度：550 ℃；質(zhì)量范圍質(zhì)荷比（m/z）50～1 000；正離子模式下，毛細(xì)管電壓為5 500 V，去簇電壓為80 V，碎裂電壓為（30 ± 15）V；負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓為4 500 V，去簇電壓為80 V，碎裂電壓為（-30±15）V。

2.2 供試品溶液制備

取樣品（編號(hào)為S1 - S3）各5 g，精密稱(chēng)定，分別置25 mL 容量瓶中，加10 mL 70%甲醇超聲15 min 使溶解，冷卻后加70%甲醇稀釋并定容，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 樣品中化合物分析

2.3.1 整體分析

取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，獲得正、負(fù)離子模式下供試品溶液的UHPLC-Q-TOF-MS 基峰色譜圖（圖1），通過(guò)文獻(xiàn)比對(duì)、同位素分布、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、二級(jí)碎片裂解規(guī)律分析，共鑒定出22 種化合物（表1），其中黃酮類(lèi)化合物6 種、有機(jī)酸類(lèi)化合物3 種、萜類(lèi)化合物7 種、酚酸類(lèi)化合物5 種、其他類(lèi)化合物（姜糖酯B）1種。

表1 舒肝散中化合物鑒定結(jié)果Tab.1 Identification of chemical components in Shugan Powder

圖1 舒肝散在正、負(fù)離子模式下的超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間-質(zhì)譜基峰色譜圖A.Negative ion mode B.Positive ion modeFig.1 UHPLC-Q-TOF-MS BPC chromatograms of Shugan Powder with positive and negative ion modes

2.3.2 黃酮類(lèi)化合物

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)具有多種藥用價(jià)值的植物次生代謝活性物質(zhì)［6］。樣品中共鑒定出6 種黃酮類(lèi)化合物，分別為兒茶素、夏佛塔苷、異甘草素、柚皮素、異鼠李素、光甘草定。

以異鼠李素為例，該化合物保留時(shí)間為3.88 min，一級(jí)質(zhì)譜信息顯示，其在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，并得到m/z315.051 2的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-，經(jīng)Sciex OS軟件（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為軟件）擬合，其分子式為C16H12O7，該化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片信息有m/z300.027 5，m/z227.035 5，m/z164.011 7，m/z151.003 6，發(fā)現(xiàn)其斷裂方式符合黃酮類(lèi)化合物斷裂規(guī)律，通過(guò)軟件擬合斷裂碎片及比對(duì)二級(jí)碎片信息，最終確定該化合物為異鼠李素。異鼠李素二級(jí)質(zhì)譜圖及化合物裂解過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖2 異鼠李素二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.2 Secondary mass spectrogram of isorhamnosin and its possible pyrolysis pathway

2.3.3 酚酸類(lèi)化合物

酚酸類(lèi)化合物具有酚羥基，在負(fù)電壓下易丟失氫離子［7-8］。樣品中共鑒定出5種酚酸類(lèi)化合物，分別為原兒茶酸、咖啡酸、迷迭香酸、3，4-二咖啡奎寧酸、阿魏酸。

以迷迭香酸為例，一級(jí)質(zhì)譜信息顯示，該化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，母離子m/z359.077 3，經(jīng)軟件擬合，其分子式為C18H16O8，該化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片信息有m/z197.045 6，m/z161.024 7，m/z133.029 5，m/z72.993 2，發(fā)現(xiàn)其斷裂方式符合酚酸類(lèi)化合物斷裂規(guī)律，通過(guò)軟件擬合斷裂碎片及比對(duì)二級(jí)碎片信息，最終確定該化合物為迷迭香酸。迷迭香酸二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解過(guò)程見(jiàn)圖3。

圖3 迷迭香酸二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.3 Secondary mass spectrogram of rosmarinic acid and its possible pyrolysis pathway

2.3.4 萜類(lèi)化合物

萜類(lèi)化合物是一類(lèi)植物、動(dòng)物、微生物中廣泛存在的化合物，具有不飽和碳碳鍵［9-10］。樣品中共鑒定出7種萜類(lèi)化合物，分別為梔子苷、芍藥苷、西紅花苷、柴胡皂苷B2、靈芝酸DM、茯苓酸、熊果酸。

以梔子苷為例，該化合物保留時(shí)間為2.07 min，一級(jí)質(zhì)譜信息顯示，其在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，并得到m/z387.130 2 的準(zhǔn)分子離子峰［M - H］-，經(jīng)軟件擬合，其分子式為C17H24O10，該化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片信息有m/z342.131 5，m/z226.084 1，m/z207.066 0，m/z164.068 5，發(fā)現(xiàn)其斷裂方式符合環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物斷裂規(guī)律，最終確定該化合物為梔子苷。梔子苷二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解過(guò)程見(jiàn)圖4。

圖4 梔子苷二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.4 Secondary mass spectrogram of gniposide and its possible pyrolysis pathway

以芍藥苷為例，該化合物保留時(shí)間為2.63 min，一級(jí)質(zhì)譜信息顯示，其在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，并得到m/z479.156 4 的準(zhǔn)分子離子峰［M - H］-，經(jīng)軟件擬合，其分子式為C23H28O11，該化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片信息有m/z327.108 1，m/z165.055 6，m/z121.029 4，m/z77.039 7，發(fā)現(xiàn)其斷裂方式符合單萜類(lèi)化合物斷裂規(guī)律，最終確定該化合物為芍藥苷。芍藥苷二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解過(guò)程見(jiàn)圖5。

圖5 芍藥苷二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.5 Secondary mass spectrogram of paeoniflorin and its possible pyrolysis pathway

以茯苓酸為例，該化合物保留時(shí)間為6.35 min，一級(jí)質(zhì)譜信息顯示，其在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，并得到m/z527.373 2 的準(zhǔn)分子離子峰［M - H］-，經(jīng)軟件擬合，其分子式為C33H52O5，該化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片信息有m/z465.337 1，m/z431.280 7，m/z221.199 1，m/z59.013 9，發(fā)現(xiàn)其斷裂方式符合三萜類(lèi)化合物斷裂規(guī)律，最終確定該化合物為茯苓酸。茯苓酸二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解過(guò)程見(jiàn)圖6。

圖6 茯苓酸二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.6 Secondary mass spectrogram of tuckaholic acid and its possible pyrolysis pathway

2.3.5 有機(jī)酸類(lèi)化合物

有機(jī)酸是一類(lèi)具有酸性基團(tuán)的有機(jī)化合物，如羥基（— COOH）、酚羥基（— C6H6O）、磺酸基（— SO3H）、亞磺酸基（—RSOOH）、硫羰酸基（—RCOSH）等［11］。樣品中共鑒定出3 種有機(jī)酸類(lèi)化合物，分別為檸檬酸、亞油酸、16α-羥基松苓新酸。

以檸檬酸為例，該化合物保留時(shí)間為0.81 min，一級(jí)質(zhì)譜信息顯示，其在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，并得到m/z191.020 1 的準(zhǔn)分子離子峰［M - H］-，經(jīng)軟件擬合，其分子式為C6H8O7，該化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片信息有m/z129.019 1，m/z111.008 7，m/z87.008 7，發(fā)現(xiàn)其斷裂方式符合有機(jī)酸類(lèi)化合物斷裂規(guī)律，最終確定該化合物為檸檬酸。檸檬酸二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解過(guò)程見(jiàn)圖7。

圖7 檸檬酸二級(jí)質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑A.Secondary mass spectrogram B.Pyrolysis pathwayFig.7 Secondary mass spectrogram of citric acid and its possible pyrolysis pathway

3 討論

3.1 前處理方法選擇

供試品溶液制備方法考察中，分別考察了以100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、水為提取溶劑，振搖15 min 與超聲15 min 2 種提取方法對(duì)舒肝散提取效果的影響。結(jié)果表明，以70%甲醇為提取溶劑，超聲15 min處理的供試品溶液的色譜信息最豐富，適用于化合物成分分析。

3.2 掃描模式選擇

本研究中采用信息依賴(lài)掃描（IDA）模式，正、負(fù)離子模式分開(kāi)采集數(shù)據(jù)，負(fù)離子模式下質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度及峰數(shù)大于正離子模式。分析原因，舒肝散中含有大量植物代謝產(chǎn)物，這類(lèi)物質(zhì)大多屬有機(jī)酸類(lèi)、酚類(lèi)、萜類(lèi)，這些類(lèi)型的化合物含有大量的羧基及羥基，在負(fù)離子模式下易失去氫離子而獲得較好響應(yīng)。正、負(fù)離子模式分開(kāi)采集提高了采集信息的豐富度，有助于在復(fù)雜化學(xué)體系中發(fā)現(xiàn)更多的化合物。

3.3 化合物確證

舒肝散為多組方中成藥，成分復(fù)雜。本研究中首次采用UHPLC-Q-TOF-MS 法分析舒肝散中的主要成分，通過(guò)軟件的質(zhì)量數(shù)偏差、同位素分布匹配、分子式查找等功能，結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配及化合物裂解規(guī)律分析，鑒定出22種化合物及其相應(yīng)結(jié)構(gòu)，成分主要為黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)。其中，異甘草素和異鼠李素為黃酮類(lèi)成分，異甘草素來(lái)源于方中甘草，異鼠李素來(lái)源于方中柴胡，具有抗炎、消食等藥理作用［12-13］；阿魏酸及迷迭香酸為酚酸類(lèi)成分，阿魏酸來(lái)源于方中當(dāng)歸，迷迭香酸來(lái)源于方中薄荷，具有抗血栓、抗病毒等藥理作用［14-15］；梔子苷來(lái)源于梔子，具有緩解兩脅疼痛、抗炎等藥理作用［16］；芍藥苷來(lái)源于白芍及牡丹皮，具有抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用［17］；茯苓酸來(lái)源于茯苓，具有緩解局部疼痛、減輕炎性反應(yīng)、抗腫瘤等藥理作用［18］；檸檬酸來(lái)源于方中多種藥材，具有疏滯、健胃等藥理作用。異甘草素、異鼠李素、阿魏酸、迷迭香酸等化合物均為首次在舒肝散中被鑒定出。相關(guān)化合物的確證為今后發(fā)掘、分析其藥效物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為今后提升舒肝散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。本研究中還發(fā)現(xiàn)一些其他未知化合物的存在，其結(jié)構(gòu)確證有待下一步研究。