分子排阻色譜-反相高效液相色譜法測定阿莫西林顆粒中高分子聚合物含量*

王顯芹，鄭如程，錢世兵，傅世玲，邢建輝，秦 亮

（1. 安徽安科恒益藥業有限公司，安徽 銅陵 244061； 2. 安徽省銅陵市食品藥品檢驗中心，安徽 銅陵 244061）

β-內酰胺類抗菌藥物包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環類、碳青霉烯類、青霉烯類抑制劑等，是臨床常用的注射劑型抗菌藥物［1］。阿莫西林是第2代青霉素類抗菌藥物，具有廣譜抗菌作用，為首選β- 內酰胺類口服抗菌藥物［2］，臨床常用于治療革蘭陰性菌、革蘭陽性菌等所致的感染性疾病、呼吸系統疾病及泌尿系統疾?。?-6］，但藥品不良反應發生率較高，過敏反應可引起β-內酰胺類抗菌藥物聚合物雜質［7］。阿莫西林的主要致敏原為其二聚體、三聚體、四聚體和五聚體，聚合度越高，引發的過敏反應越強，故應嚴格控制阿莫西林中高分子聚合物的含量［8］。2020年版《中國藥典（二部）》［9］中采用Sephadex-G10 葡聚糖凝膠柱對聚合物進行控制，但阿莫西林顆粒標準中未收錄“聚合物”檢查項?！睹绹幍洌?3 版）》［10］和《歐洲藥典（9.0版）》［11］中采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時控制聚合物雜質和一般雜質。實際應用過程中，采用Sephadex-G10 葡聚糖凝膠柱分離測定聚合物時，存在長時間使用導致柱效降低，聚合物和主峰分離度不夠，測定時間較長，測定過程煩瑣，進樣量大，對進樣設備要求高等問題。本研究中參考文獻［12-16］，在國家藥品監督管理局公布的參比制劑目錄中選擇國外L 公司的阿莫西林細粒（阿莫西林顆粒屬改劑型品種，國外原研藥無該劑型，相似劑型為細粒），以國內A公司生產的阿莫西林顆粒（參比制劑）為檢測樣本，建立了測定阿莫西林顆粒中高分子聚合物含量的分子排阻色譜-反相高效液相色譜法?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SQP QUINTIX 224-1CN 型電子天平（德國賽多利斯集團，精度為0.1 mg/0.01 mg）；S210 型pH 計（瑞士梅特勒-托利多集團）；KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有二極管陣列檢測器。

1.2 試藥

阿莫西林顆粒（A 公司，批號分別為S190601，S190801，S200301，S200302，S200303）；阿莫西林細粒（L 公司，批號分別為1903A0，9420）；阿莫西林對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為130409 - 201512，含量為86.9%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，試驗用水由Milli-Q系統制備。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Cef-SEC球狀親水硅膠柱（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液［pH 7.0，0.005 mol/L 磷酸氫二鈉-0.005 mol/L 磷酸二氫鈉（50∶50，V/V）］-乙腈（90∶10，V/V）；流速：0.6 mL / min；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品適量，精密稱定，冷水中加流動相適量，超聲5 min使溶解，加流動相定量稀釋成每1 mL含阿莫西林1.0 mg的溶液，濾過，取續濾液，即得。

對照品溶液：取阿莫西林對照品適量，精密稱定，加流動相溶解，稀釋成每1 mL含阿莫西林10 μg的溶液，即得。

系統適用性溶液：取阿莫西林對照品10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加流動相5 mL，超聲使溶解，加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL，30 ℃水浴10 min，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調酸堿性至中性，加流動相定容，搖勻，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別取供試品溶液、對照品溶液、系統適用性溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果系統適用性溶液色譜圖中，阿莫西林峰與主要降解雜質峰的分離度為7.8，符合要求。色譜圖見圖1。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖1-5.Polymer impurities 6.Amoxicillin 7.Main degradation impurities A.Test solution B.Reference solution C.System suitability solutionFig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

專屬性試驗：由藥品說明書可知，樣品中含有蔗糖、日落黃鋁色淀、糊精、枸櫞酸鈉、香蘭素、桔子香精粉末等輔料。按處方工藝分別制備缺主藥的單一輔料溶液及混合輔料溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果顯示，輔料中存在干擾峰（蔗糖峰和日落黃鋁色淀峰），故測定聚合物含量時需扣除。色譜圖見圖2。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖A.Sucrose solution B.Sunset yellow aluminum lake solution C.Mixed excipient solutionFig.2 HPLC chromatograms of the specific test

破壞性試驗：取樣品和混合輔料，分別進行堿破壞（加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液0.8 mL，室溫放置5 min，用0.1 mol/L 鹽酸溶液調至中性）和高溫破壞（80 ℃破壞8 h）后，配制成相應的強制降解供試品溶液和混合輔料溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。由圖3 可知，輔料中存在干擾峰；經堿破壞和高溫破壞的混合輔料對阿莫西林中聚合物的測定未產生明顯干擾，阿莫西林峰與其前主要降解雜質峰間的分離度均大于1.5，符合要求。

圖3 破壞性試驗高效液相色譜圖1.AmoxicillinA1，A2.Test solution（alkali damage and high-temperature damage） B1，B2.Mixed excipient solution（alkali damage and high-temperature damage）Fig.3 HPLC chromatograms of the destroyed test

線性關系考察：取阿莫西林對照品28.83 mg，精密稱定，加流動相配制成質量濃度為50.1 μg/mL 的線性貯備液；分別精密量取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得質量濃度分別為2.51，5.01，10.02，15.03，20.04，25.05，30.06，35.07 μg/mL 的系列線性溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積（A）為縱坐標、質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A= 6 278.3C- 2 554.0（r=0.999 3，n=8）。結果表明，阿莫西林對照品溶液質量濃度在2.51～35.07 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：精密量取線性關系考察項下質量濃度為2.51 μg/ mL 的線性溶液，逐級稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。取信噪比（S/N）分別為10∶1 和3∶1 時待測成分的質量為定量限和檢測限，結果分別為5.00 ng和1.60 ng。

精密度試驗：取線性關系考察項下質量濃度為10.02 μg/mL的線性溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定6 次，記錄色譜圖。結果峰面積的RSD為0.60%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：按2.2項下方法制備對照品溶液1份，于室溫下放置0，2，4，6，8 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積變化考察對照品溶液的穩定性。結果對照品溶液主峰峰面積的RSD為0.5%（n=5），表明對照品溶液室溫放置8 h 內穩定性良好。按2.2 項下方法制備供試品溶液2 份，取1 份供試品溶液于室溫下放置0，1，2，3，4，5，6，8 h 及另1 份供試品溶液于4 ℃下放置0，2，4，6，8 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，按外標法以峰面積計算聚合物含量，以聚合物含量變化量考察供試品溶液的穩定性。與0 h 相比，供試品溶液室溫、4 ℃條件下放置8 h 聚合物含量分別增加0.40%和0.04%，表明供試品溶液在室溫條件下不穩定，需臨用新制，或應保存于4 ℃下并在8 h內使用。

重復性試驗：取同一批（批號為S190601）樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，按外標法以峰面積計算聚合物含量。結果6 份供試品溶液中聚合物含量分別為0.33%，0.28%，0.26%，0.26%，0.26%，0.25%，聚合物含量最大變化量為0.08%，表明方法重復性良好。

中間精密度試驗：由不同分析人員按重復性試驗項下方法，在不同時間重新制備6 份供試品溶液。結果聚合物含量分別為0.30%，0.28%，0.27%，0.32%，0.27%，0.26%。12份供試品溶液中，聚合物含量最大變化量為0.08%，表明方法中間精密度良好。

耐用性試驗：在其他條件不變的情況下，分別微調流速、柱溫、磷酸鹽緩沖液pH、流動相比例、檢測波長，分別配制系統適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液，測定聚合物含量。結果測定的聚合物含量最大變化量為0.08%，考慮聚合物含量為多個聚合物峰及積分差異，測定誤差均在可接受范圍內；系統適用性溶液中，主峰與較大雜質峰間的分離度均大于1.5。結果見表1，由于蔗糖色譜圖中存在多個小的色譜峰，無法用保留時間描述，故未列出。

表1 耐用性試驗考察結果Tab.1 Results of the durability test

2.4 樣品含量測定

取5 批A 公司生產的阿莫西林顆粒，以2 批次L 公司生產的阿莫西林細粒為參比制劑，按2.1項下色譜條件進樣測定，按外標法以峰面積計算聚合物含量。結果A 公司5 批次阿莫西林顆粒中高分子聚合物的含量均低于參比制劑，提示A公司阿莫西林顆粒的質量不低于參比制劑。詳見表2。

表2 樣品中高分子聚合物含量測定結果（%）Tab.2 Results of the content determination of high - molecular polymer in samples（%）

3 討論

3.1 柱溫選擇

參考文獻［14］中的色譜條件（柱溫為30 ℃，其余色譜條件不變）對各單一輔料溶液、混合輔料溶液及供試品溶液進行測定。結果糊精、枸櫞酸鈉、香蘭素及桔子香精粉末對聚合物檢測基本無干擾；蔗糖與聚合物出峰位置有重合，故在計算時需扣除蔗糖峰中保留時間與聚合物峰重合的峰面積；日落黃鋁色淀峰于主峰前出峰，但峰形較差，故調整柱溫為25 ℃，此溫度下的峰形更優。

3.2 超聲時間選擇

取同一批（批號為S190601）樣品4 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，樣品溶解時分別超聲處理3，5，7，10 min，按2.1 項下色譜條件進樣測定，按外標法以峰面積計算阿莫西林顆粒中聚合物含量。結果超聲3 min 與超聲10 min 的聚合物含量基本不變，為保證樣品溶解完全及檢測結果的可重復性，同時避免超聲時間過長產生的熱量導致聚合物含量發生變化，建議超聲時間為5 min。

3.3 溶解時水溫選擇

根據阿莫西林顆粒藥品說明書中的臨床用法，使用前需用涼開水攪拌后服用。結合本品實際使用情況（即每次1 袋），取A 公司生產的阿莫西林顆粒，制備含質量濃度為3.75 mg/mL 的供試品溶液，溶解時的水溫分別選擇（25 ± 2）℃（涼開水）、40～50 ℃（溫水）、70～80 ℃（熱水），于室溫下放置3 h，考察0，1，2，3 h 時聚合物的含量。結果聚合物的含量隨溶解時水溫的升高而增加，聚合物含量越高可能導致的過敏反應發生率越高。故為保證測定結果的準確性和可重復性，建議樣品于冷水中用流動相溶解。

3.4 聚合物限度確定

根據2020年版《中國藥典（四部）》附錄［17］中有關的指導原則和ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE IMPURITIES IN NEW DRUG PRODUCTS Q3B（R2）中對雜質限度的規定，同時結合本研究中的穩定性試驗結果及參比制劑的對比結果，將本品的聚合物限度擬訂為≤標示量的3.0%。

3.5 方法評價

本研究中所建立的方法操作簡便、專屬性強、結果準確、重復性好，可用于阿莫西林顆粒中高分子聚合物的含量測定。