復方氯化鈉滴眼液中羥苯乙酯含量測定及抑菌效力評價

傅 星，楊振春，孫 麗

（江蘇省宿遷市食品藥品檢驗所，江蘇 宿遷 223800）

復方氯化鈉滴眼液是一種以氯化鈉、氯化鉀等為主要成分的多劑量眼用制劑，適用于干眼癥，眼睛疲勞等。2020年版《中國藥典（四部）》通則0105 眼用制劑規定［1］，多劑量眼用制劑一般可加適當抑菌劑以抑制微生物的滋生［2-5］。羥苯乙酯為尼泊金類抑菌劑，抑菌效果良好，廣泛用于多種眼用制劑中［6-8］，但過量使用會導致過敏反應及類激素作用［9］。2015年版《中國藥典（四部）》收載現行抑菌效力檢查法［10］，而市售復方氯化鈉滴眼液大部分首次獲批于此前，尚缺乏相關抑菌效力評價。現行標準并未對復方氯化鈉滴眼液中抑菌劑的添加量有明確要求，且無相應的檢驗方法，各生產企業的抑制劑添加量標準均不相同。從安全性考慮，有必要對該制劑進行定量檢測［11-12］及抑菌效力測定［13-15］，以評估抑菌劑的添加是否合理、有效。為此，本研究中建立了測定產品中羥苯乙酯含量的高效液相色譜法，并評價其抑菌效力。現報道如下。

1 儀器、試藥、培養基與菌株

1.1 儀器

安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XS105DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KH5200 型超聲波清洗儀（昆山禾創超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；IPP260型低溫培養箱（德國Memmert公司）。

1.2 試藥

復方氯化鈉滴眼液（A 公司，批號分別為2008041，2008281，2102231，2104081，2106161，2103071；B 公司，批號分別為210909，210606；C 公司，批號為21091401；規格均為每瓶10 mL）；羥苯乙酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100847-202105，含量為100.0%）；羥丙甲纖維素（Ⅰ型，黏度為100 mPa·s）；乙腈、磷酸二氫銨、氯化鈉均為色譜純，氯化鉀為分析純，水為超純水。

1.3 培養基

pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨培養基，胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養基，胰酪大豆胨肉體（TSB）培養基，沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養基，沙氏葡萄糖肉體（SDB）培養基，均購自北京陸橋技術股份有限公司，均已進行培養基適用性檢查。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，銅綠假單胞菌CMCC（B）10104，大腸埃希菌CMCC（B）44102，白色念珠菌CMCC（F）98001，黑曲霉CMCC（F）98003，均由中國醫學細菌保藏管理中心（CMCC）提供，用于菌液制備的工作菌株均為第3代。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/ L 磷酸二氫銨溶液（氨水調pH 至5.0）-乙腈（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：256 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取羥苯乙酯對照品10.58 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加2 mL乙腈溶解，加流動相定容，搖勻，作為標準貯備液，備用。精密量取樣品2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，作為供試品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》復方氯化鈉滴眼液項下處方工藝（除抑菌劑）配制，取氯化鈉0.9 g、氯化鉀0.014 g、碳酸氫鈉0.02 g，精密稱定，以及羥丙甲纖維素適量（視終溶液黏度調整），加注射用水至100 mL，制成空白對照溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，輔料及主藥均不干擾抑菌劑羥苯乙酯的測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.EthylparabenA.Reference solution B-D.Test solution（Lot No.：2008041，210909，21091401） E.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2項下標準貯備液，加流動相制成質量濃度分別為3.31，6.61，13.23，26.45，52.90，105.80 μg/mL的系列標準溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=56.798X-5.799 1（r=1，n= 6）。結果表明，羥苯乙酯質量濃度在3.31～105.80 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：取2.2 項下標準貯備液，加流動相逐級稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄各質量濃度下對照品峰的信噪比（S/N）。以S/N為3∶1和10∶1 時的質量濃度作為檢測限和定量限. 結果羥苯乙酯的檢測限為0.08 μg/mL，定量限為0.15 μg/mL。

精密度試驗：精密量取樣品（批號為2008041）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結果羥苯乙酯峰面積的RSD為0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取精密度試驗項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果羥苯乙酯峰面積的RSD為1.50%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取精密度試驗項下供試品溶液適量，分別于室溫放置0，4，8，12，16，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果羥苯乙酯峰面積的RSD為0.61%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號2008041）1.0 mL，共9 份，置10 mL 容量瓶中，分別加入標準貯備液0.25，0.40，0.50 mL，加流動相定容，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果平均加樣回收率為99.81%，RSD為1.42%（n=9）。

耐用性試驗：分別改變柱溫（25～35 ℃）、流速（0.8～1.2 mL/ min）、檢測波長（251～261 nm）、流動相pH 值（4.8～5.2）和色譜柱［Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Ultimate LP-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）］，其他條件不變，記錄峰面積，并計算含量。結果測定結果不受影響，表明方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

分別取9 批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表1。

表1 樣品中羥苯乙酯含量測定結果（mg/mL，n=3）Tab.1 Results of the content determination of ethylparaben in samples（mg/mL，n=3）

2.5 抑菌效力測定

2.5.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的新鮮培養物接種于TSB培養基中，取白色念珠菌和黑曲霉的新鮮培養物接種至SDB 培養基中，培養24 h 后，用pH 7.0 的無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液逐級稀釋至10-7，分別用TSA 培養基和SDA 培養基計數。根據計數結果將原菌液配制成含菌107～108cfu/mL 的菌懸液，備用。

2.5.2 抑菌效力測定

取企業A、企業B、企業C的復方氯化鈉滴眼液各5瓶，分別加入上述5種菌液0.1 mL，使每瓶滴眼液中含菌量為105～106cfu/ mL，20 ℃避光貯存，分別于6，24 h 及7，14，28 d 取樣，稀釋法計數，換算成lg 值，并與接種菌數lg值比較差值。結果見表2。

表2 樣品中羥苯乙酯抑菌效力測定結果Tab.2 Evaluation results of the bacteriostatic efficacy of ethylparaben in samples

3 討論

由表1可知，各批號的復方氯化鈉滴眼液中羥苯乙酯的含量均未超過相應標示量，各生產企業較好地控制了制劑中羥苯乙酯的含量。

通過對3 家企業生產的復方氯化鈉滴眼液進行抑菌效力評價，發現制劑中添加的羥苯乙酯的抑菌效力都不能完全達到2020年版《中國藥典（四部）》所規定的抑菌效力的要求；從抑菌效力的結果來看，制劑的抑菌效力是隨著羥苯乙酯的添加量而增強的。提示生產企業在合理范圍內可適當增加羥苯乙酯的添加量而保障制劑的抑菌效果。

現行標準對于復方氯化鈉滴眼液中抑菌劑的種類及添加量均無明確要求。眼用制劑中的常用抑菌劑有羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯扎氯銨、苯扎溴銨、硫柳汞等，市售復方氯化鈉滴眼液中的抑菌劑均為羥苯乙酯，且不同的生產企業的添加量有較大差異，但各滴眼液的抑菌效力均不符合2020年版《中國藥典（四部）》通則1121 抑菌效力檢查法的要求。

羥苯乙酯對眼刺激性較大，美國食品和藥物管理局并未推薦其在眼用制劑中使用，在口服和皮膚制劑的最大用量為0.05%［16］。相關生產企業應重新對復方氯化鈉滴眼液中所用抑菌劑種類及添加量進行篩選和評估。