瑣瑣葡萄黃酮對(duì)APP/PS-1小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

古力夏提·艾力 肖 輝 再娜甫古麗·買買提 張 鵬 袁 芳

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是癡呆癥最常見的一種形式,AD占其60%～80%。AD的病理特征包括突觸變性、老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié),最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和丟失。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查,全球每3s就會(huì)出現(xiàn)新發(fā)的AD患者,且中、低等收入國(guó)家新發(fā)病例增加趨勢(shì)尤為顯著,使其成為全球第5大死亡原因[1]。Zhao等[2]對(duì)2001～2017年文獻(xiàn)的Meta分析顯示,隨著我國(guó)老年人年齡增長(zhǎng),AD患病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。基于此,研究和開發(fā)有效的預(yù)防和治療AD的手段和藥物已成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

類黃酮是一類天然存在的多酚化合物,迄今為止,已發(fā)現(xiàn)自然界中有6000多種黃酮類化合物,其有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗衰老和抗膽堿酯酶的特性[3,4]。研究表明,黃酮類化合物及其亞類對(duì)活躍的大腦部位表現(xiàn)出多重靶向能力,顯示出對(duì)Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的抑制作用[5]。Huang 等[6]研究表明,黃酮類化合物可能是通過(guò)改善抗氧化防御系統(tǒng)和減弱線粒體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,對(duì)Aβ1～42誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙具有潛在的保護(hù)作用。瑣瑣葡萄作為新疆維吾爾自治區(qū)獨(dú)特的葡萄品種,其化學(xué)成分較復(fù)雜,黃酮類化合物是其主要生物活性成分之一。因此,本實(shí)驗(yàn)用APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠研究瑣瑣葡萄總黃酮(flavones from Vitis vinifera L,VTF)對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響,以期為臨床研究提供相關(guān)依據(jù)。

材料與方法

1.藥品和主要試劑:鹽酸多奈哌齊(上海源葉生物科技有限公司)、ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)、兔抗caspase-3 (北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、兔二步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、TUNEL試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

2.主要儀器:酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)、切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)、包埋機(jī)(常州中威電子儀器有限公司)、組織脫水機(jī)(武漢天之睿醫(yī)療科技有限公司)、攤片烤片機(jī)(上海機(jī)密儀器儀表有限公司)、NIKON正置研究級(jí)顯微鏡(日本尼康公司)。

3.動(dòng)物分組及給藥:6月齡SPF級(jí)雄性APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠75只,同齡SPF級(jí)雄性C57BL/6對(duì)照組15只,購(gòu)買自啟動(dòng)子生物科技(北京)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0004,使用許可證:SYXK(新)2018-0003,倫理學(xué)審批號(hào):IACUC-20210507-07。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天,APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠75只隨機(jī)分為模型組,陽(yáng)性對(duì)照組(多奈哌齊組,0.7mg/kg),VTF低、中、高劑量組(70、210、420mg/kg)。6月齡同背景SPF級(jí)C57BL/6小鼠15只作為空白對(duì)照組。空白對(duì)照組和模型組小鼠給予0.5%CMC-Na(0.1ml/10g)灌胃;陽(yáng)性對(duì)照組給予多奈哌齊溶液(0.7mg/kg)進(jìn)行灌胃;VTF 高、中、低劑量組灌胃分別為 420、210、70mg/kg,連續(xù)給藥8周。

4.小鼠血清制備:隨機(jī)在各組抽取6只小鼠,摘取眼球取血,頸椎脫臼處死。血樣在-4℃下保存30min,3000r/min離心15min,分離血清-20℃保存待測(cè)。

5.ELISA法檢測(cè)小鼠血清Aβ1～42含量:按照試劑盒步驟操作并檢測(cè)(在加入終止液后15min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定,將樣本A值的測(cè)定結(jié)果乘以2)。

6.免疫組化:切片脫蠟至水,抗原修復(fù);山羊血清封閉20min;隨后滴加一抗(1∶200),4℃過(guò)夜;滴加二抗工作液;DAB 顯色;蘇木精復(fù)染;封片,顯微鏡下觀察。

7.TUNEL法檢測(cè)小鼠細(xì)胞凋亡:切片脫蠟至水,蛋白酶K工作液,37℃作用20min;PBS沖洗3次,樣本浸入阻斷液(3%H2O2)中10min;TdT酶工作液,37℃濕盒避光反應(yīng)60min;Streptavidin-HRP工作液,37℃濕盒避光反應(yīng)30min;DAB顯色;蘇木精染色;封片,鏡下觀察。陽(yáng)性細(xì)胞率(%)=(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)) ×100%。

結(jié) 果

1.VTF對(duì)小鼠血清Aβ1～42含量的影響:與空白對(duì)照組比較,模型組小鼠血清中Aβ1～42含量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清中Aβ1～42含量顯著升高(P<0.05);隨著VTF藥物劑量的增加,各組APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠血清中Aβ1～42含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。并且與模型組比較,VTF低、中、高劑量組小鼠血清中Aβ1～42含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。

表1 各組小鼠Aβ1～42、caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率和細(xì)胞凋亡率比較

2.VTF 對(duì)小鼠海馬組織CA1區(qū)caspase-3蛋白表達(dá)的影響:APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬組織caspase-3蛋陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色(圖1)。模型組小鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白棕褐色陽(yáng)性產(chǎn)物與空白對(duì)照組比較,著色深且染色陽(yáng)性表達(dá)率增高(P<0.05),提示APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬caspase-3蛋白表達(dá)量增加。與模型組比較,多奈哌齊陽(yáng)性對(duì)照組和VTF各劑量組小鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白染色減弱,陽(yáng)性表達(dá)率均顯著降低(P<0.05,表1)。以上結(jié)果表明,VTF各劑量組可以不同程度下調(diào)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬CA1區(qū)caspase-3表達(dá)。

圖1 各組小鼠海馬組織CA1區(qū)caspase-3蛋白表達(dá)(IHC,×400)

3.VTF對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響:各組小鼠海馬CA1區(qū)均可以觀察到TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞(圖2,箭頭所指為陽(yáng)性細(xì)胞)。其中,空白對(duì)照組小鼠大腦海馬CA1區(qū)極少有TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞,而在模型組可見散在分布的成群的陽(yáng)性染色細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組顯著升高(P<0.05,表1),提示APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠大腦海馬CA1區(qū)存在大量凋亡細(xì)胞。鹽酸多奈哌齊陽(yáng)性對(duì)照組小鼠海馬區(qū)與空白對(duì)照組比較仍存有較多凋亡細(xì)胞,但較模型組小鼠TUNEL染色細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);VTF各劑量組與模型組比較發(fā)現(xiàn),小鼠大腦海馬CA1區(qū)TUNEL染色凋亡細(xì)胞率均顯著降低(P<0.05),其中以VTF低劑量組治療效果最為明顯。上述結(jié)果提示,VTF可能可以通過(guò)減少APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠神經(jīng)元的凋亡從而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

圖2 VTF對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響(TUNEL,×400)

討 論

當(dāng)Aβ清除途徑受損時(shí),Aβ生成與清除均衡被破壞,大量Aβ聚集在腦內(nèi),經(jīng)參與介導(dǎo)線粒體凋亡通路、死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路等多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[7]。Wu等[8]研究表明,黃酮類化合物淫羊藿苷可以通過(guò)減少Aβ1～42的沉積和抑制神經(jīng)元凋亡來(lái)改善認(rèn)知缺陷。郝凱敏[9]研究發(fā)現(xiàn),隨著APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠月齡的逐漸增加,APP/PS-1小鼠血清中Aβ1～42水平呈現(xiàn)逐漸降低的現(xiàn)象,而在海馬組織中呈相反趨勢(shì)。黃攀等[10]采用ELISA測(cè)定AD患者外周血清中Aβ1～42蛋白含量發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組患者外周血清中Aβ1～42濃度明顯低于對(duì)照組。既往研究發(fā)現(xiàn),VTF能通過(guò)下調(diào)APP/PS-1小鼠海馬APP 蛋白表達(dá)水平從而減少 Aβ產(chǎn)生,改善神經(jīng)元損傷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA檢測(cè)APP/PS-1小鼠血清中Aβ1～42濃度,分析結(jié)果顯示,模型組小鼠血清中Aβ1～42含量為2.65±0.64ng/ml,與對(duì)照組(5.02±0.22ng/ml)比較血清Aβ1～42含量顯著降低(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組和VTF各劑量組小鼠血清中Aβ1～42含量與模型組比較血清Aβ1～42顯著升高(P<0.05),與既往研究結(jié)果一致,其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡近年來(lái)被認(rèn)為是神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元死亡的一種可能機(jī)制,并且已在大量其他病理狀況中觀察到[11]。本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL染色法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn),模型組可見散在分布的成群的陽(yáng)性染色細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組顯著升高,證實(shí)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠大腦存在大量凋亡細(xì)胞。鹽酸多奈哌齊陽(yáng)性對(duì)照組和VTF各劑量組與模型組比較發(fā)現(xiàn),各組小鼠海馬CA1區(qū)TUNEL染色細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05),在VTF各劑量組中,以VTF低劑量組治療效果最為明顯,但仍比空白對(duì)照組存在較多的凋亡細(xì)胞。說(shuō)明VTF可以在一定程度上減輕APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷,減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,從而起到神經(jīng)保護(hù)作用,以上結(jié)果與大多數(shù)黃酮類化合物能夠減輕APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡研究結(jié)果一致[12～15]。

半胱天冬酶(caspase)本質(zhì)上是蛋白水解酶,是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。此前,馬麗娟[16]研究發(fā)現(xiàn),VTF、VTP可減少Aβ25～35誘導(dǎo)的AD大鼠海馬凋亡細(xì)胞數(shù)量,下調(diào) caspase-3蛋白表達(dá),從而抑制凋亡。為進(jìn)一步研究,筆者通過(guò)免疫組化法對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組小鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增多,提示APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬caspase-3蛋白表達(dá)增加。與模型組比較,VTF各劑量組小鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白染色均有不同程度變淺,其中VTF低劑量組效果最為明顯。caspase-3是caspase家族中研究最廣泛的成員之一,它是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵發(fā)起者之一。此外,TUNEL染色是一種檢測(cè)DNA片段化的方法,這是凋亡細(xì)胞死亡的特征。VTF各劑量給藥組APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬CA1區(qū)caspase-3表達(dá)和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均有不同程度減弱,說(shuō)明VTF可能通過(guò)下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá),對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用。

綜上所述,VTF對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠大腦的神經(jīng)元細(xì)胞有較好的保護(hù)作用,可以減少caspase-3蛋白在APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)的過(guò)表達(dá),減少APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡,對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠具有較好的防治作用。本研究旨在為深入探討VTF對(duì)APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠神經(jīng)保護(hù)作用的研究奠定基礎(chǔ),對(duì)于VTF活性成分改善神經(jīng)元損傷的機(jī)制,需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入探討。