PI3K、Akt與心房顫動患者射頻消融術后復發相關性

邢布點 魏 婷 冷俊杰 張 恒 康品方 張寧汝

心房顫動(atrial fibrillation,AF)是臨床上不規則的心房節律的一種。在各種因素干擾下,心房的正常電生理受損,除了誘發局灶性異位活動,還會造成折返的形成,引起心房興奮性異常增高,導致心房出現不同步收縮,心室不規則興奮,除造成心臟的損傷外,還會加重心臟的負荷[1,2]。就AF而言,心房纖維化與之緊密相連。如在AF患者中,心房纖維化程度是增加的[3]。AF發病通常始于陣發性發作,隨著發作次數的增加或時間持續的增加,就會演變為持久型AF,即“AF誘發AF”現象[1]。心房纖維化介導心房重構,繼而促進AF發生和進展,而在心房重構過程中,AF促使心房纖維化,造成惡性循環的形成,使心律失常持續存在,表明心房纖維化與AF相關[3～6]。

PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶,能夠結合胞內Akt,促進Akt的磷酸化激活進而啟動一系列信號聯級反應[7]。Akt被PI3K激活后,能激活其下游多種靶點蛋白,繼而參與機體內各種重要的生理及病理過程。PI3K/Akt信號通路是參與調節細胞生長、增殖等多種生物學過程的信號轉導通路,特別是在心臟疾病發生、發展中起重要作用。近年來研究發現,PI3K/Akt信號通路在小鼠AF模型中表達是下調的,并用激活劑活化其通路,能夠減少心房纖維化的程度,進而減少了AF的發作[8～10]。而目前該信號通路與AF患者疾病進展、AF射頻消融術后復發有何關系尚未明確。因此,本研究擬通過觀察AF患者血漿以及外周血單核細胞中中磷酸化PI3K、Akt表達水平,并分析PI3K、Akt與左心房內徑(left artrial diameter,LAD)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)之間的相關性,從而進一步探討PI3K/Akt信號通路在AF患者中相關作用。

資料與方法

1.材料試劑:磷酸化PI3K抗體(貨號:17366,美國CST公司)、磷酸化Akt抗體(貨號:4060,美國CST公司)和β-actin抗體(貨號:8457,美國CST公司);ELISA檢測試劑盒:HumanPI3K(貨號:YX-160914H,上海羽朵生物科技有限公司)、Akt(貨號:YX-011120H,上海羽朵生物科技有限公司)

2.研究對象:選取2019年1月～2020年11月蚌埠醫學院第一附屬醫院住院確診且首次接受射頻消融術的AF患者,嚴格按照入選標準及排除標準納入145例為實驗組。入選標準:本研究中選取的AF類型為持續性AF,其定義為持續超過7天的AF發作,其包括7天后因藥物或電復律而終止發作的AF或AF的持續時間為12個月以上。對照組選用同時期至筆者醫院體檢者120例。所有研究對象入組時均排除嚴重心血管疾病如合并有急性心肌梗死、風濕性心臟病、先天性心臟病、心臟瓣膜病,肝腎功能不全,腫瘤,精神疾病患者等。入選患者均簽署知情同意書,研究方案獲得筆者醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號: 2019KY023)。

3.方法:(1)樣本準備:留取實驗組術前及對照組外周靜脈血10ml,置于肝素鈉抗凝試管中,2h內以3000r/min離心15min,取離心后的上層血漿保存至-80℃冰箱。(2)PBMCs的分離:在取完上層血漿的標本中加入PBS至總體積14ml,混勻后加入14ml的淋巴分離液,2000r/min離心20min,取PBMC層的細胞,用PBS重懸細胞,1500r/min離心15min,棄上清,加入配置好的凍存液,轉移至凍存管中保存至-80℃冰箱。(3)ELISA法檢測所有受試者血漿中PI3K、Akt水平:所有標本中PI3K、Akt濃度嚴格按照ELISA說明書進行檢測,在酶標儀上讀取450nm處吸光值,根據相應的標準曲線計算血漿中PI3K、Akt水平。(4)Western blot法檢測PI3K/Akt信號通路在對照組和實驗組中的磷酸化PI3K、Akt蛋白的表達:收集的外周靜脈血加入裂解液,提取PBMCs中總蛋白,依據BCA蛋白定量法說明書,測定各組蛋白濃度,配置10%SDS-PAGE電泳,PVDF膜轉膜;脫脂牛奶常溫封閉;一抗室溫孵育4h(或4℃過夜);TBST洗滌3次,10分/次;二抗孵育2h;TBST洗滌3次,10分/次;洗膜后ECL發光液曝光,凝膠成像系統獲取圖像。(5)臨床隨訪:隨訪檢查主要包括體表心電圖或動態心電圖以及心臟彩超指標,相關心電圖記錄AF有無復發。AF復發定義:心電圖檢查出現至少30s的AF/心房撲動/心房快速心律失常復發。

結 果

1.受試者臨床資料比較:除基本資料,受試者在肝腎功能等生化指標比較,差異無統計學意義(P>0.05),受試者LAD、LVEF、左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVDd)以及左心室短軸縮短率(shortening rate of left ventricular short axis,LVFS)比較,差異有統計學意義(P<0.05,表1)。

表1 兩組臨床基線資料比較

2.各組受試者血漿中PI3K、Akt的表達含量的比較: ELISA檢測結果顯示,實驗組血漿中PI3K、Akt表達水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05,表2)。

表2 兩組PBMC中PI3K、Akt水平比較

3.兩組PBMCs中磷酸化PI3K以及Akt蛋白表達水平:實驗組磷酸化PI3K(0.51±0.07mU/L)、AktBMI.體重指數;RBC.紅細胞計數;WBC.白細胞計數;ALT.谷氨酸氨基轉移酶;AST.天門冬氨酸氨基轉移酶;HDL.高密度脂蛋白;LDL.低密度脂蛋白;Scr.血肌酐;LAD.左心房前后徑;LVDd.左心室舒張末期內徑;LVEF.左心室射血分數;LVFS.左心室短軸縮短率(0.72±0.09ng/ml)蛋白表達水平較對照組磷酸化PI3K(0.97±0.18mU/L)、Akt(1.13±0.09ng/ml)呈下調趨勢,差異有統計學意義(P<0.01,圖1)。

圖1 兩組PBMCs中磷酸化PI3K、Akt蛋白表達水平

4.實驗組患者血漿中PI3K、Akt與LAD、LVEF的相關性分析:Pearson相關性檢驗結果顯示,AF患者血漿PI3K與LAD之間呈顯著負相關(r=-0.549,P<0.001),Akt與LAD之間呈顯著負相關(r=-0.641,P<0.001); PI3K與LVEF之間呈顯著正相關(r=0.565,P<0.001),Akt與LVEF之間呈顯著正相關(r=0.463,P<0.001)。

5.臨床隨訪:對術后患者進行為期 10～12個月的隨訪,平均隨訪時間為11.21±0.42個月,共隨訪112例,失訪33例。根據是否復發分為復發組與未復發組,比較兩組患者血漿PI3K、Akt濃度以及LAD大小。復發組血漿PI3K、Akt水平低于未復發組,差異有統計學意義(P均< 0.001);復發組LAD高于未復發組,差異有統計學意義(P<0.001,表3)。對實驗組術后患者,以是否發生復發為因變量,以表3中存在差異的變量(PI3K、Akt、LAD)為協變量,應用二元Logistic回歸分析,顯示PI3K(OR= 1.478, 95%CI:1.098～2.021,P=0.002)、Akt(OR=1.072,95%CI:1.027～1.136,P=0.004)、LAD(OR=1.179, 95%CI:1.070～1.346,P=0.010)是AF術后復發的獨立危險因素(表4)。

表3 導管射頻消融術后兩組相關指標的比較

表4 AF術后復發多因素二元 Logistic 回歸分析

討 論

近年來AF發生率逐年上升,其機制尚未有定論,可能與沖動傳導異常、心臟重構等相關[11～14]。其中,心房重構在AF的發病機制中的作用越來越受到研究者的認可,其被認為是AF發生、持續存在的重要病理基礎[15]。LAD常被用作評估心房重構的重要參數[16]。相關研究發現,LAD是AF患者心血管事件的危險因素,且隨著AF患者LAD的升高,AF的嚴重程度相應增加,經射頻消融術后再次復發率也越高,LAD增大可視為AF發生的獨立危險因素,這些研究表明,LAD與AF的發生和進展密切相關[17,18]。

本研究發現,實驗組LAD顯著高于對照組(P<0.01),進一步佐證了心房結構重構參與了AF發生、發展,且血漿PI3K、Akt水平分別與心房重構指標LAD呈一定的負相關,提示其信號通路可能通過介導心肌纖維化的方式促使心房重構,進而誘發了AF發生、進展。心房纖維化是心房結構重構的主要過程,在AF的發生和持續中起著關鍵作用[19]。Li等[20]研究發現了心房纖維化與AF可能存在關聯性后,這種關聯性不久便被進一步得到了驗證,在充血性心力衰竭犬模型中,心房纖維化的進行性發展與房性心律失常誘發易感性的增加密切相關[21]。這表明心房纖維化過程是治療AF一個潛在的靶點。而動物模型進一步表明了AF和心房纖維化之間的關聯性,如2型糖尿病小鼠模型中,心房纖維化的增加,發生AF的敏感度顯著增加[22]。AF患者體內能檢測到心房纖維化標志物(如TGF-β1、CTGF、Gal-3)的升高[23～25]。

PI3K是磷脂酰肌醇家族中一個重要成員,作為一種胞內磷脂酰肌醇激酶,根據其結合底物的偏好和序列同源性,可將其分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,臨床以Ⅰ型PI3Ks研究最為廣泛。Ⅰ型 PI3Ks又被分為ⅠA類和ⅠB類,ⅠA類PI3K是調節心血管系統穩態的主要PI3K,其是由具有調節功能的亞基p85和具有催化功能的亞基p110異源二聚體的組成, 能夠特異性催化磷脂酰肌醇的三位羥基而被磷酸化, 產生多磷酸肌醇PIP2和PIP3, 能激活其下游的蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),進而募集和激活下游的靶分子啟動一系列信號聯級反應[26～28]。

Akt又被稱為蛋白激酶B,其被上游信號分子的PI3K的激活可以促使其發生磷酸化而被激活,進而參與了各種生理及病理過程。PI3K(p110α)信號通路參與多種疾病,特別是心血管疾病[29]。Pretorius 等[8]在小鼠模型中發現,敲除PI3K基因組PI3K的活性下調可引起小鼠心房纖維化,下調心房鉀通道表達,增加了基因敲除組AF易感性。Xu等[30]在大鼠模型中觀察到,通過抑制PI3K/Akt信號轉導通路,使得大鼠心房纖維化程度增加,進而誘發了AF的發生。而Singhal等[9]通過實驗表明,秋水仙堿能夠通過上調PI3K、Akt的表達,進而起到了改善心房纖維化程度,促進復極時鉀離子外流,減少了AF發作的次數的作用。Xue等[10]在2型糖尿病小鼠模型中觀察到硫化氫能夠激活PI3K/Akt信號通路,減少小鼠心房纖維化進而降低了AF易感性。這些實驗表明PI3K/Akt信號轉導通路通過介導心房纖維化,進而誘發AF的發病和進展。

本研究發現,實驗組患者血漿PI3K、Akt水平低于對照組,提示PI3K、Akt與AF發病有關。同時,本研究檢測AF患者PBMCs中PI3K/Akt信號通路的磷酸化PI3K、Akt 表達水平較對照組患者也是呈下調的趨勢,提示AF的發病可能與PI3K/Akt信號通路表達下調有關。

隨著研究的深入,盡管導管射頻消融明顯改善了AF患者的預后,但AF復發仍很常見,其復發的機制越來越引起人們的關注,但其具體機制尚不明確。有研究表明LAD是射頻消融術后AF復發的獨立危險因素[31]。本研究Pearson相關分析提示,PI3K、Akt水平分別與心房重構指標LAD呈負相關。為此根據PI3K/Akt水平評估射頻消融術后AF復發尚未有定論。基于此,本研究對于接受射頻消融術后的AF患者進行為期11.21±0.42個月的隨訪,隨訪發現,射頻消融術后復發組患者LAD水平較未復發組明顯升高。同時,射頻消融術后復發組患者血漿PI3K、Akt水平較未復發組是明顯降低的。同時,本研究行二元Logistic回歸分析顯示,不僅LAD是AF術后復發的獨立危險因素,且PI3K、Akt同樣是AF術后復發的獨立危險因素,提示PI3K/Akt信號通路的表達下調可能與射頻消融術后患者的復發有關。

綜上所述,本研究發現PI3K/Akt信號通路在AF患者的蛋白表達水平明顯降低的,且血漿PI3K、Akt水平分別與心房重構指標LAD呈一定的負相關,提示其信號通路可能通過介導心肌纖維化的方式促使心房重構,進而誘發了AF發生、進展。同時,對于射頻消融術后的臨床隨訪發現,射頻消融術后患者的復發可能與PI3K/Akt信號通路的表達下調有關,這為射頻消融術后復發機制研究提供了一個新的思路和見解。