乳牙牙髓干細胞分化前后的外泌體miRNA篩選研究

黃燕華 劉 澍 李言鳳

齲病因其具有發生率高、分布廣等特點,已成為人類常見慢性病之一[1]。目前,齲齒的治療方法主要是以人工合成材料來替代缺損的牙體組織,但是這并不能完全恢復牙齒的生物學性能,導致牙體抵抗力降低,進而對牙髓組織造成不同程度的損傷,最終導致治療的失敗[2]。

乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)作為一種成體干細胞,具有較強的增殖和自我更新能力,在礦化誘導液的作用下可成牙本質向分化并形成類牙本質樣結構,故被認為是修復性牙本質形成中理想的種子細胞[3]。因此,以SHED為研究對象,深入闡明成牙本質向分化的機制,將有助于修復性牙本質的形成。

外泌體(exosome,Exo)是間充質干細胞主動分泌的大小均一、直徑在200nm以內的一種細胞外囊泡[4]。近年來關于牙源性間充質干細胞的外泌體相關研究越來越多[5],研究證明Exo可通過其攜帶的microRNA(miRNA)發揮促進細胞增殖分化、抑制細胞凋亡、促進血管生成等作用。miRNA 長度僅為20～25nt,具有高度保守性、表達時序性和組織特異性等特點,保守估計,人類約有2/3 的蛋白編碼基因受miRNA調控,miRNA幾乎參與所有生命活動的調節[6]。然而 miRNA 數量眾多,仍有諸多未知miRNAs 可能與成牙本質向分化有關。

SHED外泌體(SHED-exosome, SHED-Exo)的特性及它所能發揮的作用研究尚少,它如何調控分化功能的機制也還沒有明確報道[7]。本研究利用基因芯片技術,篩選分析在SHED分化過程中的外泌體的差異表達的miRNAs,初步探討其在SHED分化過程中可能發揮的作用,進而為修復性牙本質形成工程提供新的方向和理論依據。

材料與方法

1.材料:DMEM培養基、胎牛血清FBS、雙抗(美國Gibco公司);無外泌體的血清(美國System Biosciences公司);成骨培養基、成脂培養基(美國ScienCell公司);茜素紅染色試劑盒、油紅O染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);ALP活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);反轉錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑(德國QIAGEN公司);蛋白定量試劑盒、蛋白質印跡發光液(美國Thermo Scientific 公司);流式抗體CD146-PE、CD29-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45(美國Biolegend ebioscience公司);CD63、CD9單克隆抗體(美國Santacruz公司)等。

2.標本收集:來源于2020年4～7月就診于南京醫科大學附屬婦產醫院兒童口腔科,因替牙期乳牙滯留或者二度松動需要拔除的乳牙。所有志愿者無關節炎病史及全身系統性疾病史,并且2個月內未服用免疫抑制劑及抗菌藥物。所有標本獲取均取得患者知情同意并經筆者醫院醫學倫理學委員會批準{倫理學審批號:寧婦倫字[2020]KY-028號}。將新鮮拔除的乳牙在頸部使用渦輪機磨一引導溝,置入盛有DMEM培養基的無菌離心管中,用裝有冰塊的保溫桶迅即運輸至實驗室。

3.SHED的分離培養及鑒定:在超凈臺內,使用切斷鉗在引導溝處夾斷牙齒,用鑷子將牙髓取出,PBS多次沖洗,在DMEM培養基中剪成約 0.5～1.0mm3大小,并加入 1ml Ⅰ型膠原酶(3mg/ml) 和中性蛋白酶(4mg/ml),37℃消化 45min,收集細胞與組織碎塊移入培養瓶中,加入含 10% FBS的DMEM培養基。SHED表面標志物的流式鑒定:PBS洗細胞3次,重懸,計數,以1×105/100μl分裝至離心管內,分別加入2μl CD146-PE、CD29-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-PE,室溫避光孵育1h,離心,過濾,重懸,移至流式細胞管內,上機檢測。SHED多向分化能力的鑒定:當細胞生長至80%時,分別更換為礦化誘導培養基和成脂誘導培養基,培養21天,每3天換液1次,分別進行茜素紅和油紅O染色,用倒置顯微鏡觀察并拍照。

4. SHED的堿性磷酸酶(ALP)活性檢測:礦化誘導7、14和21天后,分別用ALP試劑盒檢測。PBS洗兩次,在4℃條件下0.2% Triton X-100過夜裂解。然后,根據說明書將工作液添加到細胞裂解液中,孵育后,用自動酶標儀在520nm處測量每個樣品的吸光度值。

5.超速離心法收集SHED-Exo及鑒定:待細胞生長至80%時,PBS洗兩次,更換為含10%無外泌體的FBS培養基,培養48h,收集培養液,進行如下離心步驟(300×g4℃離心10min,2000×g4℃離心10min,10000×g4℃離心30min)。透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)形態學檢測:PBS稀釋后,滴在可輝光放電的150目formvar銅網上,4℃孵育2min,洗滌銅網,用2%乙酸雙氧鈾溶液負染,并干燥,在80kV電壓下觀察。納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)粒徑:PBS稀釋后,將樣本注入樣品池,用蓋子封住樣品池;按照標準操作流程操作儀器檢測。Western blot法鑒定表面標志物:設置SHED蛋白作為對照, 分別提取SHED以及SHED-Exo的蛋白,測定蛋白濃度,垂直電泳,轉膜,封閉;孵育一抗CD9(23～27kDa)和CD63(26kDa),4℃過夜,加入相應的二抗,常溫孵育1h,ECL法檢測暗室曝光。

6.分化前后的SHED-Exo的miRNAs表達譜檢測:按照生物公司的送樣要求,將處理過的分化前后的細胞上清液保存在干冰中,送至上海康成生物技術有限公司,由該公司完成外泌體的 miRNAs 基因芯片檢測。

7.實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR):用Trizol試劑提取細胞樣本總RNA,反轉錄為cDNA后使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行qPCR擴增。GAPDH作為內參檢測選定成牙分化相關的基因,U6作為內參檢測選定的miRNAs的表達,用2-ΔΔCT法測定相對表達量。成牙分化相關基因的引物序列為:OPN上游引物:5′-AGCCAGGACTCCATTGACTCGAAC-3′和下游引物:5′-GTTTCAGCACTCTGGTCATCCAGC-3′;DSPP上游引物:5′-CAACCATAGAGAAAGCAAACGCG-3′和下游引物:5′-TTTCTGTTGCCACTGCTGGGAC-3′; DMP1上游引物:5′-CAGGAGCACAGGAAAAGGAG-3′和下游引物:5′-CTGGTGGTATCTTGGGCACT-3′; OSX上游引物:5′-GCCAGAAGCTGTGAAACCTC-3′和下游引物:5′-GCTGCAAGCTCTCCATAACC-3′;GAPDH上游引物:5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′和下游引物:5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。miRNA的引物由銳博生物公司設計,通過Bulge-loopTMmiRNA qRT-PCR引物組(每組1個RT引物和1對qPCR引物)對miRNAs進行定量,對每個miRNA進行特異性檢測。

8.生物信息學分析:通過miRDBV5和TargetScan7.1進一步預測驗證的差異表達miRNAs的靶基因,然后對重疊靶點進行GO分析和KEGG通路的功能分析。

結 果

1.SHED的培養鑒定:SHED細胞大多數為梭形或多角形,礦化誘導培養7、14和21天后,ALP活性和成牙分化相關基因(OPN、DSPP、DMP1、OSX)明顯增強;顯微鏡下觀察,在礦化誘導培養基中培養21天的SHED可見明顯的紅色礦物結節,在成脂誘導液培養21天的SHED可見細胞間形成紅色發亮小脂滴。(圖1中A～D)流式細胞儀檢測分析,分離培養的SHED表達 CD146,CD29,CD90,CD105,陽性率分別為 25.55%、99.11%、99.24%和0.71%,該結果與文獻報道的間充質干細胞特征相一致(圖1E)。

圖1 原代分離的SHED的形態學和鑒定

2.SHED-Exo的鑒定:TEM結果顯示,分化前后的SHED-Exo直徑為100～150nm,呈現典型的茶托形雙層膜結構;NTA結果顯示分化前后的外泌體粒徑均一,且峰值分別為134.3nm和136.7nm;SHED-Exo的CD63、CD9表面蛋白表達量,與對照組SHED細胞蛋白比較,表現為明顯的上調;以上特征均符合外泌體特征(圖2)。

圖2 SHED-Exo的形態學和表型的鑒定

3.分化前后的SHED-Exo的miRNAs表達譜鑒定:在分化前后的SHED-Exo中共鑒定出215個miRNAs,其中有37個miRNAs表達顯著差異(13個下調<0.2倍和24個上調>5倍,表1、表2)。采用芯片的miRNAs 的標準值進行聚類分析,關系近的miRNAs會聚到一起(圖3A)。為了進一步確定芯片結果的準確性,隨機選擇了13個有顯著差異表達的miRNAs,通過qRT-PCR進行驗證。結果顯示,miR-4449、miR-199b-5p、miR-30c-1-3p、miR-4497、miR-31-5p、miR-1973和mir -3178均顯著上調(P<0.05),miR-4482-3p、miR-3121-5p、miR-335-5p和miR-370-3p顯著下調(P<0.05);miR-3195和miR-711比較差異無統計學意義(P>0.05,圖3B)。這些結果表明,上述13個驗證的miRNAs在芯片和qRT-PCR的結果基本一致。由于差異表達的miRNAs數量較多,選擇上述13個經驗證的顯著表達的miRNAs進行靶基因預測,共得到438個重疊靶基因(圖3C)。

圖3 miRNA芯片的檢測結果及驗證

表1 分化前后的SHED-Exo的下調miRNAs(下調<0.2倍)

表2 分化前后的SHED-Exo的上調miRNAs(上調>5倍)

4.生物信息學分析:為了進一步獲得與上述miRNA相關的靶基因的生物學信息,筆者進行GO和KEGG分析。通過KEEG通路分析上述miRNAs最可能調控的前10條信號通路為FoxO信號通路、Ras信號通路、Hippo信號通路、基底細胞癌和MAPK信號通路等。GO分析后得到的靶基因主要富集在多細胞生物發育、單細胞生物等生物學過程中;細胞成分主要受細胞部分、面上泡和囊泡等影響;主要分子功能指標包括鈣離子結合、淀粉樣蛋白結合、蛋白轉運體活性以及MAP激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性等 (圖4)。

圖4 差異表達miRNA的靶基因的功能分析

討 論

隨著細胞生物學和口腔醫學的發展,牙源性干細胞越來越受到人們的關注,主要是由于從新鮮拔牙中分離的細胞具有低免疫原性,可以在臨床上高度利用[8]。近年來,大多數研究主要集中在恒牙牙髓干細胞體外培養后一些生物學行為的變化,而對更容易獲得的SHED在礦化后生物學特性的研究報道較少[9]。由于外泌體具有作為遞質將信號分子傳遞給受體細胞,能改變其生物學功能的作用,從而引起國內外研究者的重視。外泌體具有精準且高效的作用機制,并且其易于保存,在外泌體攜帶的眾多生物分子中,miRNAs可以調控基因表達[10]。因而exosome-miRNA的靶向治療技術具有極高的轉化應用前景。

盡管已有研究揭示了牙源性干細胞分化過程中存在一些具有調控功能的miRNAs,但仍有許多miRNAs及其調控的靶基因未被發現[11,12]。本研究中,通過miRNA芯片檢測,在未分化和分化的SHED-Exo中共鑒定了215個差異表達的miRNAs。在這些miRNA中,有13個被qPCR驗證并進行生物信息學分析。分化前后的SHED-Exo下調最顯著的miRNA是miR-335-5p,目前對miR-335-5p的研究顯示出它和成骨分化具有相關性。例如,Zhao等[13]在體外證實,miR-335-5p的過表達可能是骨髓干細胞(BMSCs)生物學中的一個關鍵調控因素,主要是通過下調WNT信號通路抑制劑Dickkopf相關蛋白1 (DKK1)來促進成骨分化。

有研究表明,牙本質的形成過程與成骨過程相似,即成骨細胞分化和成牙本質向分化是通過相似的過程完成的[14]。因此,可以推測miR-335-5p可能也會參與成牙本質向分化過程,研究結果中的其他miRNAs,包括miR-370-3p和miR-199b-5p,也被發現參與成骨分化的過程[15, 16]。此外,生物信息學分析發現靶基因在FoxO信號通路、MAPK信號通路等信號通路中顯著富集,這兩個信號通路已經被報道調控牙源性分化[17, 18]。因此,從靶點預測和功能分析結果來看,分化前后的SHED-Exo中的miRNAs可能會通過這些信號通路調控成牙本質向分化,但還需要進一步探索。

綜上所述,本研究結果擴展了目前對SHED成牙本質向分化過程的認識,這可能為修復性牙本質形成提供新的見解和理論基礎。