血漿同型半胱氨酸與早發缺血性腦卒中易感相關性

金 銘 王寧寧 鄭夢琳 武 楠 林樹東 張智龍 才奇博 鄭玉婷 張 昊 胡 瑩 周宇忱 李雪巖 楊秀靜 邱長春 李靜平

腦卒中是多基因、遲發性和極具破壞性的神經系統疾病,約80%是缺血性腦卒中,其遺傳病因學尚未完全闡明[1]。我國腦卒中發生率存在明顯地域化差異,呈現北高南低,黑龍江省腦卒中發生率居全國第一[2,3]。雖然,許多研究認為血漿同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高是缺血性腦卒中的獨立風險因素,但是其分子作用機制仍缺少實質性了解[4～6]。

Hcy是葉酸代謝狀態最敏感的標志物。Hcy水平來自食物平衡、遺傳因素和(或)兩者協同作用。葉酸代謝是復雜的過程,包括多種互相依賴可提供甲硫氨酸合成和DNA、RNA及蛋白質甲基化作用所需甲基供體的酶促反應構成的網絡系統[7,8]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)是葉酸代謝通路中的重要酶,也是Hcy生成的關鍵限速酶。MTHFR的功能是催化5,10-甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸,它是Hcy向甲硫氨酸轉化所需甲基供體的前體物[9～11]。本研究以Hcy作為中介表型,探討血漿同型半胱氨酸水平,MTHFR基因C677T多態性與LAA IS易感風險性。

材料與方法

1.研究人群:本研究采用基于群體的病例/對照研究,已獲得齊齊哈爾醫學院醫學倫理學委員會批準{倫理學審批號:齊倫審[2022]52號},并征得每位參加者的知情同意。研究納入2612例無血緣關系世居北緯47°～53°高寒地區漢族人樣本。病例組樣本847例,為發病年齡≤55歲的大動脈粥樣硬化(large artery atherosclerosis,LAA)缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)病例;對照組樣本1765例。病例選擇:病例樣本取自齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院。病例診斷根據神經癥狀出現并經過CT和(或)MR影像證實。按照TOAST分型標準,排除心源性腦卒中、小動脈閉塞性腦卒中、出血性腦卒中、短暫性腦缺血發作和其他不明原因的缺血性腦卒中。對照選擇:通過基于自愿的免費常規查體,選擇年齡、性別、民族、居住地相匹配,數量(病例∶對照=1∶2)為1765例健康對照個體。納入標準:①年齡≥40歲;②至少3代居住在該地區,無異民族婚配;③排除高血壓、心臟病、腦卒中和其他神經系統疾病(如老年癡呆等)個人和家族病史。

2.研究方法:(1)人口學資料:通過問卷調查,獲取被調查對象的年齡、性別、職業、民族、本人及家族病史(高血壓、糖尿病、冠心病、心、腦血管病、老年癡呆等神經系統疾病),吸煙、飲酒及飲食習慣等相關資料。(2)人體學資料:通過常規全面查體獲得人體學資料。測量身高、體重,計算體重指數(body mass index, BMI),BMI≥28kg/m2為肥胖。使用臺式汞柱式血壓計測量血壓和心率。按國際標準在未服藥情況下,收縮壓(systolic blood pressure, SBP)≥140mmHg和(或)舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)≥90mmHg為高血壓。使用指夾式脈搏血氧儀測量血氧飽和度(西藏華大科技有限公司),本研究中的血氧飽和度為3次測定的平均值。(3)實驗室檢驗:使用全自動生化分析儀(貝克曼AU5800)測定甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血糖、血尿酸、肌酐。(4)同型半胱氨酸水平測定:取急性期LAA IS患者空腹外周血5ml,EDTA抗凝。3000r/min離心10min,取上清血漿-80℃保存,待測定血漿Hcy水平。應用酶聯免疫吸附實驗法測定Hcy水平。

3.基因分型:(1)制備基因組DNA:使用柱式中量DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物技術有限公司),從外周血白細胞分離基因組DNA。將沉淀DNA溶于GE緩沖液(10mmol/L Tris-Hcl,1mmol/L EDTA-Na2,pH值為8.0),-20℃保存。使用微量分光光度儀(Thermo Nano drop 2000)測定DNA濃度和純度,其純度達A260/A280≥1.80。(2)基因分型:采用Sequenom Mass Array質譜技術,使用Spectrochip-G384芯片單引物延伸法,利用UCSC在線工具設計引物,分別從病例、對照組隨機選取20例樣本進行DNA測序,兩種方法符合率達100%。

結 果

1.研究人群的基本特征:病例組(n=847,男性/女性=466/381,平均年齡為52.48±6.76歲)和對照組(n=1765,男性/女性=666/1099,平均年齡為50.82±8.87歲)的生理和生化檢測結果詳見表1。病例組的收縮壓139.93±18.37mmHg和舒張壓87.72±11.92mmHg明顯高于對照組收縮壓118.32±13.16mmHg和舒張壓77.46±8.95mmHg,差異有統計學意義(P<0.001),同時脈壓差也呈現出這種趨勢,說明高血壓是腦卒中的主要危險因素。

表1 研究人群的基本特征

2.MTHFR C677T基因型和等位基因頻率分布:兩組人群MTHFR C677T基因型分布未偏離Hardy-Weinberg平衡,P>0.05。病例組TT純合基因型頻率(2.13%)明顯高于對照組(0.85%)。未調節影響因素時,OR為2.578(95%CI:1.291～5.150,P=0.007)。為了排除年齡、性別的可能影響,筆者針對年齡、性別進行調整,調整后的OR為2.430(95%CI:1.177～5.014,P=0.016)差異仍有統計學意義,說明基因型TT與LAA IS易感相關(表2)。分析3種不同遺傳模式效應結果詳見表3。隱性遺傳模式效應最強,OR為2.533(95%CI:1.270～5.051,P=0.008),調整年齡、性別后,OR為2.398(95%CI:1.164～4.942,P=0.018),說明TT基因型的隱性遺傳模式是LAA IS的危險因素(圖1)。

圖1 不同種族人群MTHFR基因C677T變異隱性遺傳模式與LAA IS易感相關效應比較

表2 MTHFR C677T基因型與等位基因頻率在病例組與對照組間的頻率分布[n(%)]

表3 3種遺傳模式(加性、顯性和隱性)的效應分析

3.MTHFR C677T基因型與血漿同型半胱氨酸水平:病例組平均血漿Hcy水平14.04±7.77μmol/L明顯高于對照組11.04±4.51μmol/L。組間同一基因型比較,也是病例組高于對照組,提示除了MTHFR C677T多態性外,可能還有其他因素影響患者血漿Hcy水平(圖2)。進一步觀察了病例組基因型和血漿Hcy水平相關性。結果表明,病例組中TT純合基因型攜帶者血漿Hcy水平明顯高于CT和CC基因型攜帶者,依次為TT (22.26±11.11μmol/L)>CT(19.98±8.69μmol/L)>CC(11.78±2.19μmol/L)。

圖2 MTHFR基因型與血漿Hcy水平比較

討 論

缺血性腦卒中是多基因、遲發性復雜疾病的典型范例。高度遺傳異質性是缺血性腦卒中遺傳病因學研究的主要瓶頸。為了便于篩查、鑒定其易感基因,本研究以同型半胱氨酸作為特定中介表型,以急性、早發大血管動脈硬化型缺血性腦卒中作為研究對象進行分層分析,其優點是:①使研究人群遺傳背景趨于均一,減少遺傳噪音影響;②早發型較遲發型病例可富集更多外顯性強的基因變異,即使是同一基因變異在早發病例中的效應強于遲發型病例,可提高統計學強度。

MTHFR是相對分子質量為70～77kDa的二聚體蛋白質,其編碼基因定位于人類染色體短臂1p36.6區域,具有多態性,迄今已鑒定出10多種單核苷酸多態性位點[12]。MTHFR C677T功能性變異是最常見且被廣泛研究的多態性位點。MTHFR基因第677位胞嘧啶被胸腺嘧啶取代,致使酶蛋白第222位丙氨酸(Ala)變為纈氨酸(Val),降低酶的熱穩性和酶活性。在37℃,677 TT純合基因型較野生CC純合基因型,酶活性可降低50%～60%;在46℃,酶活性可降低65%,從而引起血漿Hcy水平升高,發生高同型半胱氨酸血癥[13,14]。本研究病例組中,Hcy水平與不同基因型的相關性呈現TT>TC>CC趨勢。同時,基因型OR也呈現TT>TC>CC的趨勢,兩者關系變化趨勢的一致性,說明Hcy水平升高是缺血性腦卒中獨立風險因素與MTHFR C677T變異密切相關。

MTHFR基因C677T變異頻率存在明顯地域變化和種族差異[15]。研究數據表明,在歐洲西班牙人和意大利人MTHFR 677T等位基因頻率較高,而美國黑種人和非洲黑種人MTHFR 677T等位基因頻率較低。同是白種人,在歐洲西班牙人和意大利人677 TT純合基因型頻率較高(21%),而德國人TT純合基因型頻率最低。此外,非歐洲的白種人,如加拿大、美國、巴西和澳大利亞的白種人,MTHFR 677TT純合基因型頻率變化在10%～14%。非洲黑種人TT純合度幾乎為零;而生活在美國和巴西的黑種人TT純合度極低,僅為1%～2%。有關亞洲人群研究資料較少,日本人MTHFR基因677TT純合頻率約為11%,印度人是0～1.2%[16,17]。在我國,不同研究報告漢族人MTHFR基因677T等位基因或TT純合基因型頻率差異較大[18]。

本研究MTHFR C677T基因型與缺血性腦卒中易感相關性結果顯示,在隱性遺傳模式,TT純合基因型的OR是2.398(95%CI:1.164～4.942,P=0.018)明顯高于Mao等[18]報告的遲發性患者OR值(OR=1.920,95%CI:1.190～3.100,n=130,平均年齡為68.42±13.26歲,LAA IS患者),說明MTHFR基因變異可能在早發患者中起更重要作用。

多項研究表明,血清Hcy水平升高預示著平滑肌和內皮細胞損傷,導致活化凝血因子,抑制纖溶酶原激活劑表達,促進內皮增生,從而進一步抑制凝血酶表達和組織型纖溶酶原激活劑和硫代肝素的合成。最終通過炎性細胞因子分泌,血小板凝集,內質網應激和氧化應激反應導致動脈粥樣硬化和凝血。動脈粥樣硬化和凝血都是缺血性腦卒中的重要危險因素[19]。因此,本研究結果有助于揭示血清Hcy水平升高作為缺血性腦卒中獨立風險因素的遺傳病因學分子基礎。