ARID1A下調促進甲狀腺癌細胞增殖和凋亡的作用機制

達布西力特 鄭 皓 韓承新 肖晶晶

SWI/SNF 染色質重塑在包括組織發育、分化和 DNA 復制在內的各種細胞生長發育過程中起著關鍵的作用[1]。SWI/SNF 復合物通過ATP 來動員核小體,從而調節啟動子對轉錄激活或抑制[2]。富含AT的相互作用域 1A 基因 (ARID1A) 負責編碼SWI1結構和功能,它包含 DNA 結合基序,是 SWI/SNF 復合物的一個重要組成部分[3]。因此,ARID1A 對 SWI/SNF 復合物抑制 DNA 合成至關重要,并且已被證明對正常細胞周期停滯也同樣重要。

近年來,相關研究報道ARID1A 為一種抑癌基因[4,5]。ARID1A 在子宮內膜來源的腫瘤中具有很高的體細胞突變發生率,許多ARID1A突變是插入或缺失突變,這將導致編碼蛋白質的缺失。有關研究已經表明,ARID1A 蛋白表達的喪失與 ARID1A 突變密切相關[6,7]。此外,據報道ARID1A 表達的降低與膠質瘤的病理分級相關,并且ARID1A 的缺失與 EBV(-)MLH1 保留的胃癌中的腫瘤直徑、晚期浸潤深度、淋巴結轉移和不良預后相關[8]。

編碼SWI/SNF染色質重塑復合物亞單位的基因在所有人類癌癥中累積突變20%以上。ARID1A是最常見的SWI/SNF亞單位基因,并在分子和組織學亞型癌癥下發生突變。近年來研究確定了ARID1A在SWI/SNF復合物定向到組織特異性維護其染色質的結構和功能中起到了關鍵作用[9,10]。在ARID1A缺陷的情況下,將會導致基因表達的廣泛失調,從而導致腫瘤的形成。ARID1A突變的晚期癌癥患者免疫治療的總體存活時間大幅延長,表明其可以用于預測免疫治療在多種癌癥類型的生存受益情況[11]。目前,ARID1A 的臨床意義及其在甲狀腺癌中的生物學功能仍未明確。本研究分析了甲狀腺癌中ARID1A蛋白的表達情況,并分析了ARID1A表達與臨床病理因素之間的相關性。此外,本研究通過檢查甲狀腺癌細胞系的增殖和紫杉醇耐藥性來探究 ARID1A 在甲狀腺癌發生、發展中的作用機制。

材料與方法

1.腫瘤組織樣本:選取納入2019年8月～2020年8月筆者醫院病例檔案中檢索到的106例甲狀腺癌患者病例資料。此外,組織學診斷和分化分級由筆者醫院兩名病理科醫師根據標準獨立進行評估。研究已獲得患者及家屬知情同意,并簽署知情同意書。本研究經筆者醫院臨床醫學倫理學委員會批準[倫理學審批號:(2019)倫審第(42)]。

2.免疫組化實驗:所有手術切除的腫瘤標本用10%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋,制備4μm厚切片。用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物方法(中國Ultra SensitiveTM公司)進行免疫染色。此外,切片在二甲苯中脫蠟,在分級乙醇系列中再水化,并在高壓滅菌器中在 0.01mol/L 檸檬酸鹽緩沖液(pH值為6.0)中煮沸2min。最后,使用過氧化氫 (0.3%) 抑制內源性過氧化物酶活性,然后與正常山羊血清孵育以減少非特異性結合。ARID1A (1∶200, 美國Sigma公司) 的一抗在4℃下孵育過夜,切片用非免疫IgG平行染色以提供陰性對照。然后通過EliVision plus試劑盒(貨號:KIT-9903,中國麥新公司)檢測抗體結合的情況,再使用DAB色原進行可視化,其切片用蘇木精復染、脫水并封片。兩名獨立研究者隨機檢查所有腫瘤載片的5個視圖,在 400 倍放大倍數下每個視圖觀察 100 個細胞,通過評估代表性腫瘤區域、強度和細胞百分比,按照半定量標準對 ARID1A 的免疫染色進行評分。腫瘤細胞的核染色被認為是陽性免疫染色。ARID1A 染色的強度也被評分為 0(無染色)、1(弱)、2(強)分。百分比分數被指定為 1(1%～25%)、2(26%～50%)、3 (51%～75%) 和 4 (76%～100%)分。將每個腫瘤樣本的分數相乘得到0～8分的最終分數,ARID1A的總表達被確定為評分<4分:ARID1A低表達;評分≥4分:高表達。

3.細胞培養和小干擾 RNA:正常人甲狀腺上皮細胞 TEC、甲狀腺癌細胞系SW579、BCPAP、KAT18、TPC-1和FTC133購自ATCC,將細胞放置在 RPMI-1640 (型號:C11875500BT, 美國Invitrogen公司) 中培養,并在 37℃ 和 5% CO2中添加 10% 胎牛血清,實驗前 24h將細胞接種于6孔板。ARID1A SMARTpool 小干擾 RNA (siRNA) 混合物和對照 siRNA (型號:M-00353,美國Dharmacon公司)。根據試劑使用的說明,使用 DharmaFECT1 試劑(貨號:T-2001-01,美國Dharmacon公司)對細胞進行轉染操作。

4.蛋白質印跡實驗:在裂解緩沖液(Pierce,美國Rockford公司)中提取細胞的總蛋白,用 Bradford 法進行定量。使用 10% SDSPAGE 分離30μg蛋白,并轉移到 PVDF 膜(貨號:ISEQ00010,美國Millipore公司)。同時在4℃下與抗ARID1A(1∶500,美國Sigma公司)、細胞周期蛋白 D1(Cyclin D1)、Bcl-2、p-Akt(1∶1000,細胞信號,英國Abcam公司)的兔抗體一起孵育。洗滌后,將膜與過氧化物酶偶聯的二抗(美國Santa Cruz Biotechnology公司)在 37℃ 下在繼續孵育2h。使用 ECL(Pierce)觀察蛋白質條帶,并使用 BioImaging Systems (貨號:CA94785,美國UVP公司) 進行檢測。此外,基于對照組的 GAPDH 蛋白來計算其相對蛋白質的表達水平。

5.MTT增殖試驗:轉染 24h后,將細胞接種于含有 10% FBS培養基的96 孔板中(每孔約 2000個)。為定量細胞活力,將 20μl 5mg/ml MTT(3-4, 5-二甲基噻唑-2-基-2, 5-二苯基溴化四唑,美國Sigma公司)溶液添加到每個孔中并在37℃下持續孵育4h。棄培養基,并將所得的 MTT 甲臜溶解在 150μl DMSO 中。溶液在 490nm下進行分光光度法測量。

6.集落形成試驗:轉染48h后,將細胞種植到6cm細胞培養皿中(每皿1000個細胞)孵育14天。然后用吉姆薩染色細胞,并計數超過50個細胞的集落數。

7.細胞凋亡檢測:細胞凋亡檢測采用Annexin V/PI雙染法。轉染48h后,用0.25%胰蛋白酶收集細胞,冷 PBS 洗滌兩次,然后重懸在250μl結合緩沖液中。在細胞懸液中加入含有 Annexin V/FITC 和碘化丙啶的染色溶液,并在黑暗中孵育30min后,最后通過FACSCalibur流式細胞儀(貨號:BD FACSCalibur,美國Becton Dickinson公司)分析。

結 果

1.ARID1A在甲狀腺癌中表達的臨床意義:通過免疫組化研究了106例甲狀腺癌組織和10例正常甲狀腺組織中ARID1A的表達情況。ARID1A的核染色被認為是陽性的,在正常甲狀腺組織中,癌旁組織中觀察到強核染色(圖1中A、B)。甲狀腺癌組織中,70例核ARID1A染色強,36例染色減弱(圖1中C～F),即ARID1A蛋白主要積累在腫瘤細胞核中。分析ARID1A下調與臨床病理因素之間的關系發現,ARID1A下調與腫瘤分化差(P=0.024)、TNM分期(P=0.009)和淋巴結轉移情況(P=0.024)等相關性顯著, 但在年齡、性別和腫瘤組織學中,未觀察到 ARID1A 明顯的表達差異有統計學意義(P>0.05),詳見表1。

圖1 ARID1A在甲狀腺正常組織及甲狀腺癌中的表達情況(×400)

表1 甲狀腺癌組織中ARID1A基因的表達與臨床病理特征的關系(n)

2.ARID1A缺失促進甲狀腺癌的細胞增殖和存活:在一組甲狀腺癌細胞系中通過蛋白質印跡分析ARID1A的相對表達水平,并根據組織樣本,與正常TEC 細胞系比較,甲狀腺癌細胞系中的ARID1A蛋白表達顯著降低,尤其是在SW579和KAT18中(圖2A)。FTC133和BCPAP細胞系具有相對較高的ARID1A水平。使用ARID1A特異性siRNA抑制了ARID1A的表達,并通過蛋白質印跡分析證實了ARID1A表達缺陷的情況(圖2B)。ARID1A 缺失大大提高了細胞的增殖率(對照siRNA vs ARID1A siRNA, FTC133:1.281±0.062 vs 1.737±0.034,P<0.05;BCPAP:0.925±0.028 vs 1.208±0.025,P<0.05)和集落形成的潛力(siRNA對照 vs ARID1A siRNA, FTC133: 129±15 vs 215±19,P<0.05;BCPAP:179±15 vs 369±18,P<0.05,圖3中A、B)。細胞凋亡能力如圖3C所示,與對照siRNA(FTC133:25.5%;BCPAP:16.4%)比較,在 ARID1A敲低的細胞中觀察到早期和晚期顯著降低的凋亡百分比(FTC133:18.8%;BCPAP:10.5%),該實驗結果證明 ARID1A 敲低抑制甲狀腺癌細胞凋亡(圖3C)。

圖2 ARID1A在甲狀腺癌細胞系中的表達及其敲低效果

圖3 ARID1A缺陷促進細胞增殖,并抑制細胞凋亡

3.ARID1A 調節Cyclin D1、Bcl-2 和 Akt 磷酸化:檢測ARID1A缺陷細胞和對照細胞之間的一組生長相關蛋白發現,ARID1A敲低顯著提高了Cyclin D1、Bcl-2和Akt磷酸化水平(圖4)。

圖4 ARID1A敲低后Cyclin D1、Bcl-2和Akt磷酸化蛋白表達情況

討 論

ARID1A 表達的缺失已在各種癌癥中得到證實,ARID1A表達降低與胃癌的淋巴結轉移、腫瘤浸潤和患者預后不良有關[12]。此外,ARID1A缺失還與上皮性卵巢癌的化學耐藥性和子宮內膜癌的腫瘤進展相關[13]。本研究證明了甲狀腺癌組織中ARID1A蛋白表達降低,這與淋巴結轉移和pTNM分期顯著相關。此外,甲狀腺癌細胞系中ARID1A的表達缺失促進增殖并抑制細胞凋亡,這與先前顯示ARID1A作為腫瘤抑制因子的觀點保持一致。

相關研究表明了ARID1A作為腫瘤抑制因子的證據。恢復ARID1A的表達能夠抑制小鼠模型的腫瘤細胞增殖和生長[14]。相反,沉默ARID1A表達可增強小鼠腫瘤異種移植模型中的細胞增殖和致瘤作用,這也與本研究結果一致。此外,在白血病細胞系中敲低ARID1A可以抵抗Fas介導的細胞凋亡[15]。本研究發現ARID1A缺失可以抑制紫杉醇敏感度并提高甲狀腺癌存活率。通過進一步檢查幾種細胞凋亡和增殖相關蛋白,發現ARID1A耗竭上調了Cyclin D1和Bcl-2的表達,Cyclin D1在甲狀腺癌中過度表達,并在G1-S檢查點促進癌細胞增殖和細胞周期的進程。Bcl-2是多種癌癥中的一種抗細胞凋亡蛋白,其上調會導致細胞不死亡的現象[16]。這些結果都表明ARID1A可以通過調節Cyclin D1和Bcl-2來調節細胞增殖和凋亡。

目前對ARID1A功能喪失導致癌癥進展的機制知之甚少。在分子水平上,ARID1A/BRG1復合物已被證明與p53直接相互作用,轉錄調節由p21、SMAD3等編碼的下游因子[17]。此外,研究證明ARID1A可以調節子宮內膜癌細胞系中的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路活性,ARID1A過表達通過PI3K途徑抑制神經膠質瘤細胞增殖以及降低p-Akt和p-S6K的表達[18,19]。本研究表明,ARID1A缺失明顯激活甲狀腺癌細胞系中的Akt磷酸化,Akt通過BAD磷酸化和促存活基因的激活來調節細胞凋亡和存活,并且Akt的激活也被證明可以克服G1期的細胞周期停滯。Akt已被證明是一種有前景的癌癥治療靶點。因此,ARID1A的生物學作用可能取決于其與Akt通路的相互作用。

綜上所述,本研究證實了ARID1A蛋白在甲狀腺癌中的表達下調及其與pTNM分期、淋巴結轉移等的相關性。此外,本研究結果表明ARID1A缺失可以促進甲狀腺癌細胞的增殖,抑制細胞凋亡,這可能是通過Akt介導的Cyclin D1和Bcl-2調節來實現的。鑒于這些發現,ARID1A在甲狀腺癌中是一個重要的腫瘤抑制因子,未來需要開展深入研究探討其分子機制。