副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用

張鵬云，陳敏，劉明星，周紅，藺輝星，范紅結(jié)

副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095

【背景】副豬嗜血桿菌（，HPS）是豬的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起斷奶前后和保育階段的豬發(fā)病，通常見(jiàn)于5—8周齡的青年豬，發(fā)病率一般為10%—15%。該菌有15種血清型，目前主要養(yǎng)豬國(guó)家流行的血清型為4型、5型、12型和13型，是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要細(xì)菌性病原之一。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有檢測(cè)該菌抗體的商品化試劑盒。【目的】研制一種針對(duì)副豬嗜血桿菌的快速、敏感和特異性強(qiáng)的抗體檢測(cè)試劑盒，為格拉瑟氏病的有效防控提供技術(shù)支持。【方法】表達(dá)并純化OppA、DppA、HbpA 3種不同的副豬嗜血桿菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體周質(zhì)底物結(jié)合蛋白，使用副豬嗜血桿菌陰、陽(yáng)性參考血清篩選以上3種蛋白中免疫反應(yīng)性和反應(yīng)特異性好的蛋白。以篩選的蛋白為包被抗原，建立檢測(cè)HPS抗體的間接ELISA方法，優(yōu)化間接ELISA 反應(yīng)條件，并組裝試劑盒。在此基礎(chǔ)上，確定該試劑盒的敏感性、特異性；通過(guò)對(duì)不同時(shí)間、不同豬場(chǎng)采集的2 000份臨床豬血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該試劑盒的實(shí)用性；在以上臨床血清樣本中隨機(jī)選取200份，分別以研制的試劑盒、間接血凝試驗(yàn)以及進(jìn)口商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證該試劑盒的符合率；最后，使用研制的試劑盒檢測(cè)免疫和攻毒豬采集的血清，評(píng)價(jià)該菌免疫后的抗體消長(zhǎng)規(guī)律。【結(jié)果】成功表達(dá)并純化了OppA、DppA、HbpA 3種蛋白，發(fā)現(xiàn)OppA免疫反應(yīng)性和反應(yīng)特異性最好。經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化，確定OppA包被濃度為1 μg·mL-1，封閉液為0.5%的BSA-PBS溶液，樣品稀釋液為1%的BSA-PBST溶液，樣品孵育時(shí)間為30min，樣品稀釋度為1﹕50，酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間為3 0min，底物作用時(shí)間為15 min，臨界值為0.18；試劑盒的敏感性和特異性為96.67%，能與國(guó)內(nèi)常見(jiàn)血清型HPS陽(yáng)性血清反應(yīng)而不與豬其他常見(jiàn)病原陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)；2 000份臨床血清樣本陽(yáng)性檢出率為34.65%；隨機(jī)抽取200份血清樣本，與間接血凝試驗(yàn)的符合率為92.50%，與進(jìn)口商品化試劑盒符合率為87.00%，符合率較高；使用試劑盒檢測(cè)免疫和攻毒后不同時(shí)間采集的豬血清，HPS抗體消長(zhǎng)規(guī)律符合預(yù)期。【結(jié)論】研制的副豬嗜血桿菌ELISA抗體檢測(cè)試劑盒特異性高、敏感性強(qiáng)，與商品化試劑盒和間接血凝試驗(yàn)的符合率高，可用于臨床HPS抗體檢測(cè)和疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。

副豬嗜血桿菌；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體周質(zhì)底物結(jié)合蛋白；間接ELISA；免疫評(píng)價(jià)

0 引言

【研究意義】副豬嗜血桿菌（，HPS）是豬的機(jī)會(huì)致病菌，為巴斯德菌科、嗜血桿菌屬的革蘭氏陰性菌[1-2]，主要引起1—4月齡豬的呼吸道感染，造成格拉瑟氏病，以纖維蛋白性多漿膜炎、多關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為臨床特征，死亡率可高達(dá) 50%[3-4]。該菌易與其他豬呼吸道病原發(fā)生共感染，危害更加嚴(yán)重[5-8]。2019年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部宣布豬用飼料全面禁止添加抗生素，格拉瑟氏病在豬場(chǎng)流行愈發(fā)嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)造成了極大損失[9]。該病診斷主要通過(guò)臨床癥狀、病理病變以及病原菌的分離鑒定，但這些方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)[10-11]；血清學(xué)診斷快速、敏感，但該病目前還缺乏血清學(xué)診斷國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1, 4]。因此，有必要建立一種血清學(xué)診斷方法，用于該病的流行病學(xué)調(diào)查和疫苗評(píng)價(jià)。【前人研究進(jìn)展】研究人員已建立多種血清學(xué)方法對(duì)該病進(jìn)行診斷，包括補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)（IHA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等[11-14]。其中，間接血凝試驗(yàn)主要以高溫煮沸的細(xì)菌上清、OppA為致敏抗原，但是操作繁瑣，重復(fù)性差；使用抽提的HPS多糖、脂多糖或單體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白rApd建立的間接ELISA方法，可用于HPS抗體檢測(cè)，但反應(yīng)敏感性和特異性差，結(jié)果不穩(wěn)定[15]。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體周質(zhì)底物結(jié)合蛋白（SBP）能結(jié)合細(xì)菌周質(zhì)中的底物并將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是開(kāi)發(fā)抗菌劑和疫苗的潛在靶標(biāo)[16-18]。OppA、HbpA和DppA是常見(jiàn)的SBP蛋白，在寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)和血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮作用[19-22]。MACEDO等研究表明10株HPS臨床分離株和13株HPS參考菌株中均表達(dá)OppA，而豬常見(jiàn)的10種其他細(xì)菌的全菌蛋白均不表達(dá)OppA，說(shuō)明OppA在HPS中保守，且不與其他豬病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)[11]。【本研究切入點(diǎn)】副豬嗜血桿菌給養(yǎng)殖業(yè)造成較大危害，已經(jīng)報(bào)道的血清學(xué)診斷方法敏感性、特異性低，而國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上沒(méi)有該病的ELISA試劑盒，進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足檢測(cè)需求。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】篩選HPS抗體檢測(cè)最適包被抗原，優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件，建立高敏感性和特異性的ELISA試劑盒，并進(jìn)行大量臨床試驗(yàn)，與間接血凝試驗(yàn)和進(jìn)口試劑盒比較。為副豬嗜血桿菌的快速檢測(cè)、診斷、流行病學(xué)調(diào)查和疫苗評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年10月至2021年10月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 細(xì)菌與血清

副豬嗜血桿菌SQ株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)試驗(yàn)室保存。48份副豬嗜血桿菌陰陽(yáng)性參考血清，10份特異性質(zhì)控血清（包括9份豬其他病原陽(yáng)性血清），6份國(guó)內(nèi)常見(jiàn)血清型陽(yáng)性血清以及免疫豬和攻毒豬血清，均由該實(shí)驗(yàn)室制備、檢驗(yàn)和保存，所有血清均使用副豬嗜血桿菌間接血凝試驗(yàn)檢驗(yàn)[14]，血清型特異性血清使用KRG方法檢驗(yàn)特異性[23]。豬臨床血清采自周邊不同豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

HRP 標(biāo)記羊抗豬抗體購(gòu)自北京莊盟生物有限公司；進(jìn)口副豬嗜血桿菌間接 ELISA 試劑盒購(gòu)自加拿大Biovet公司；單組分TMB 顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；酶標(biāo)儀Infinite 200 PRO NanoQuant購(gòu)自瑞士TECAN公司。

1.3 引物

研究所用引物均由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

斜體帶虛線堿基為酶切位點(diǎn) Dashed bases in italics are restriction sites

1.4 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建與重組蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

以副豬嗜血桿菌 SH0165（GenBank 登錄 CP001321.1）在 NCBI 上公布基因序列為參考，設(shè)計(jì)和表達(dá)引物。以HPS-SQ株基因組為模板PCR 擴(kuò)增3個(gè)片段，并和pET28a進(jìn)行對(duì)應(yīng)雙酶切， T4 DNA 連接酶連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含有卡那霉素（50 ng·μL-1）的LB平板，PCR和酶切分別鑒定重組質(zhì)粒，陽(yáng)性克隆送測(cè)序。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，即為重組蛋白表達(dá)菌。蛋白表達(dá)和純化使用文獻(xiàn)[24]方法。挑取單克隆在37℃培養(yǎng)過(guò)夜，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約0.6—1.0，加入0.1 mmol·L-1IPTG，16℃、200 r/min轉(zhuǎn)速下繼續(xù)培養(yǎng)20 h，收集細(xì)胞，破碎后于4℃以12 000r/min離心20 min收集上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上鎳柱，利用不同濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，使用副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清經(jīng)Western-blot鑒定蛋白特異性。收集蛋白，使用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，-80℃凍存。

1.5 副豬嗜血桿菌間接ELISA抗原的選擇和間接ELISA試劑盒的建立

分別采用2 μg·mL-1的rOppA、rHbpA和rDppA包被的酶標(biāo)板檢測(cè)48份陰陽(yáng)性參考血清，間接ELISA方法按照常規(guī)方法操作[25-26]。選取效果最佳的蛋白，優(yōu)化抗原包被濃度、最佳封閉液、樣品稀釋度、最佳樣品稀釋液、樣品反應(yīng)時(shí)間、二抗稀釋液、二抗工作濃度、二抗反應(yīng)時(shí)間和底物反應(yīng)時(shí)間等，根據(jù) OD 值和 P/N 值建立間接 ELISA 方法。統(tǒng)計(jì)試制的副豬嗜血桿菌ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)60份陽(yáng)性血清和60份陰性血清的結(jié)果，通過(guò)ROC曲線分析[27]，確定副豬嗜血桿菌ELISA抗體檢測(cè)方法的臨界值，從而建立HPS抗體檢測(cè)試劑盒。

1.6 特異性、敏感性檢驗(yàn)

取9種實(shí)驗(yàn)室制備保存的豬其他常見(jiàn)病原陽(yáng)性血清，用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，研究其特異性；取6種實(shí)驗(yàn)室制備保存的副豬嗜血桿菌國(guó)內(nèi)常見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)血清型特異性陽(yáng)性血清，用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，研究其敏感性。

1.7 符合率和臨床應(yīng)用

用試劑盒檢測(cè)來(lái)自5個(gè)省份不同時(shí)間采集的共2 000份臨床血清樣品，計(jì)算其陽(yáng)性率。在臨床樣品中隨機(jī)抽取200份，用試劑盒和間接血凝試驗(yàn)[14]以及商業(yè)化試劑盒同時(shí)檢測(cè)這些臨床血清，計(jì)算陰陽(yáng)性檢出率和符合率；用試劑盒檢測(cè)使用副豬嗜血桿菌相隔兩周兩次攻毒和使用商業(yè)化疫苗相隔兩周兩次免疫不同時(shí)間采集的血清，分析其抗體強(qiáng)度變化。

2 結(jié)果

2.1 蛋白的表達(dá)、純化、鑒定和篩選

表達(dá)3種蛋白，大小均在預(yù)期范圍內(nèi)（圖1-A），純化后得到純度較高的目的蛋白（圖1-B），使用副豬嗜血桿菌陽(yáng)性血清經(jīng)Western-blot鑒定蛋白特異性（圖1-C），BCA試劑盒測(cè)量蛋白濃度。分別使用2μg·mL-1的蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)48份陰陽(yáng)性參考血清，結(jié)果顯示，rOppA蛋白檢測(cè)的OD450值可以明顯區(qū)分出陰陽(yáng)性血清，而rHbpA和rDppA不明顯（圖1-D），因此，選擇rOppA作為間接ELISA包被抗原。

A：3種蛋白的表達(dá); M:蛋白標(biāo)準(zhǔn), 1：空質(zhì)粒表達(dá)菌，2-4： rOppA、rDppA和rHbpA表達(dá)菌株；B：3種蛋白的純化M:蛋白標(biāo)準(zhǔn), 1-3：rOppA、rDppA和HbpA蛋白；C：3種蛋白的鑒定M：蛋白標(biāo)準(zhǔn), 1-3：rOppA、rDppA和HbpA蛋白；D：抗原的篩選

2.2 ELISA條件的優(yōu)化和試劑盒的建立

以rOppA包被酶標(biāo)板，進(jìn)行條件優(yōu)化，根據(jù) OD 值和 P/N 值確定了最佳抗原包被濃度為1 μg·mL-1、最佳封閉液為0.5%的BSA-PBS溶液、最佳樣品稀釋液為1%的BSA-PBST溶液、最佳樣品孵育時(shí)間為30 min、最佳樣品稀釋度為1﹕50、最佳酶標(biāo)二抗稀釋度為1﹕20 000、最佳酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間為30 min、最佳底物孵育時(shí)間為15 min。根據(jù)已優(yōu)化的條件，檢測(cè)60份陽(yáng)性血清和60份陰性血清，統(tǒng)計(jì)其OD450nm（圖2-A），繪制ROC曲線（圖2-B），結(jié)果顯示，當(dāng)OD值＜0.1789時(shí)，敏感性和特異性較高，均為96.67%，選擇該OD值作為臨界值，即當(dāng)OD450nm≥0.18時(shí)，判定為HPS抗體陽(yáng)性，當(dāng)OD450nm＜0.18時(shí)，判定為HPS抗體陰性，此時(shí)，ROC曲線下面積（AUC）最大，為0.9972。

2.3 特異性、敏感性檢驗(yàn)

取豬其他常見(jiàn)病原陽(yáng)性血清，包括豬大腸桿菌陽(yáng)性血清（）、豬胸膜肺炎放線桿菌陽(yáng)性血清（App）、豬肺炎支原體陽(yáng)性血清（Mhp）、豬鏈球菌2型陽(yáng)性血清（SS2）、豬丹毒絲菌陽(yáng)性血清（Ery）、經(jīng)典豬瘟陽(yáng)性血清（CSFV）、豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒陽(yáng)性血清（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型陽(yáng)性血清（PCV2）和豬偽狂犬病陽(yáng)性血清（PRV），用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)9種血清均檢測(cè)為陰性（圖3-A），說(shuō)明試劑盒與豬常見(jiàn)其他病原的抗體不發(fā)生交叉反應(yīng)；取制備的副豬嗜血桿菌國(guó)內(nèi)常見(jiàn)血清型特異性陽(yáng)性血清，包括血清1型、血清4型、血清5型、血清12型、血清13型和血清14型，用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均檢測(cè)為陽(yáng)性（圖3-B）。

A：rOppA-ELISA檢測(cè)120份陽(yáng)性和陰性豬血清的結(jié)果分布；B：ROC曲線

A：特異性檢驗(yàn)；B：敏感性檢驗(yàn) A: The result of specificity test; B: The result of sensitivity test

2.4 臨床樣品檢測(cè)

使用試制的試劑盒檢測(cè)來(lái)自江蘇、安徽、浙江、山東和河南等不同省份豬場(chǎng)采集的兩批共2 000份臨床血清，總陽(yáng)性率為34.65%，其中2019年5月采集的5個(gè)省份共1 000份血清中，抗體陽(yáng)性率范圍為17.45%— 35.88%，總陽(yáng)性率為24.80%；2020年11月采集的相同豬場(chǎng)共1 000份血清中，抗體陽(yáng)性率范圍為36.36%— 54.12%，總陽(yáng)性率為44.50%（表2），均有較大幅度上漲。

2.5 試劑盒符合率研究

通過(guò)檢測(cè)200份隨機(jī)臨床血清，發(fā)現(xiàn)本試劑盒與國(guó)外進(jìn)口試劑盒的符合率為87.00%，與間接血凝試驗(yàn)符合率為92.50%（表3），其中，進(jìn)口試劑盒將18份血清判定為疑似，這18份疑似血清中，有8份血清的檢測(cè)結(jié)果與IHA相同，另外10份與IHA結(jié)果不同。

2.6 檢測(cè)免疫豬和攻毒豬血清樣本

采用試劑盒檢測(cè)免疫豬和攻毒豬血清樣本，其中PBS組4頭豬4周內(nèi)均為陰性，疫苗組直到二免后一周才產(chǎn)生抗體，有一頭豬的血清始終為陰性的，可能為免疫失敗（圖4-A）。通過(guò)腹腔注射感染副豬嗜血桿菌強(qiáng)毒菌株SQ株的5頭豬的血清在第一次攻毒后第7天開(kāi)始已經(jīng)產(chǎn)生抗體（圖4-B）。

表2 臨床試驗(yàn)結(jié)果

表3 符合率試驗(yàn)

3 討論

由于傳統(tǒng)的副豬嗜血桿菌血清學(xué)診斷方法存在缺陷，急需使用有優(yōu)勢(shì)的ELISA方法進(jìn)行取代[15]。遺憾的是，我國(guó)的副豬嗜血桿菌病ELISA檢測(cè)試劑盒完全依賴進(jìn)口，目前仍然沒(méi)有被批準(zhǔn)上市的國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒。筆者通過(guò)篩選到的一種特異性和敏感性較好的蛋白作為包被抗原，建立了ELISA試劑盒，該試劑盒經(jīng)過(guò)與間接血凝試驗(yàn)和進(jìn)口商業(yè)化試劑盒進(jìn)行比較，符合率高。

3.1 包被抗原的選擇和試驗(yàn)條件的優(yōu)化

目前已經(jīng)建立的ELISA方法多采用細(xì)菌脂多糖和外膜蛋白作為包被抗原，但是試驗(yàn)證明脂多糖和外膜蛋白均易與其他細(xì)菌的血清發(fā)生交叉反應(yīng)。使用HPS單體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Apd作為包被抗原建立間接ELISA方法，同樣可以識(shí)別HPS 15種血清型參考菌株，但是該研究只是使用了Wetern-blot方法進(jìn)行驗(yàn)證[15]；近年來(lái)，神經(jīng)氨酸酶蛋白Neu也被報(bào)道作為ELISA的檢測(cè)抗原[28]。OppA屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體周質(zhì)底物結(jié)合蛋白，該類蛋白具有能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)抗體水平的特點(diǎn)[29-30]。有研究顯示，OppA蛋白在副豬嗜血桿菌中保守，且在其他常見(jiàn)豬細(xì)菌病原中不存在，可稱是優(yōu)質(zhì)的檢測(cè)用抗原，該研究建立了OppA-ELISA方法，不過(guò)并未對(duì)建立的ELISA方法進(jìn)行特異性和敏感性研究[11]。本研究為OppA可以作為HPS的診斷抗原提供了更充足的證據(jù)。

A：商業(yè)滅活疫苗免疫組；B：強(qiáng)毒株SQ攻毒組

3.2 試劑盒臨界值的設(shè)定

合理的臨界值對(duì)于ELISA試劑盒的準(zhǔn)確性至關(guān)重要[31]。在間接ELISA方法的建立研究中，多直接使用檢測(cè)OD值作為判定依據(jù)[32]，或使用樣品檢測(cè)值與陽(yáng)性對(duì)照值的比值S/P作為判定依據(jù)[33]。由于在ELISA檢測(cè)中陰性對(duì)照的檢測(cè)值最為穩(wěn)定，受人為和環(huán)境的影響較小，所以本研究使用了P/N值作為陰陽(yáng)性判定的依據(jù)。在前人對(duì)于HPS間接ELISA方法的研究中，臨界值的確定均使用了檢測(cè)陰性樣品平均值X±3SD法[34]，這種方法已逐漸被ROC曲線法所取代，ROC曲線法是目前ELISA試劑盒研制中常用的方法之一[35]。

3.3 試劑盒敏感性和特異性評(píng)價(jià)

在前人的研究中，多未對(duì)建立的副豬嗜血桿菌ELISA方法進(jìn)行全面的敏感性和特異性研究。Neu-ELISA方法未對(duì)豬大腸桿菌陽(yáng)性血清和豬肺炎支原體陽(yáng)性血清做出研究，不足以完全說(shuō)明試驗(yàn)的特異性[28]；在研究Apd-ELISA方法時(shí)，敏感性和特異性研究使用了免疫印跡法，該方法只能證明相應(yīng)菌株中是否存在與Apd多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)的蛋白，無(wú)法說(shuō)明對(duì)應(yīng)的抗體是否與Apd重組蛋白發(fā)生反應(yīng)[15]，這種方法驗(yàn)證ELISA的敏感性和特異性可能存在較大的局限性。本研究建立的ELISA試劑盒，敏感性和特異性均達(dá)到了96.67%，并對(duì)試劑盒是否可以檢出6種我國(guó)常見(jiàn)血清型陽(yáng)性血清以及9種豬常見(jiàn)病原陽(yáng)性血清做出了研究，充分證明了OppA作為診斷抗原的可行性。

3.4 試劑盒實(shí)用性評(píng)價(jià)

OppA-ELISA檢測(cè)免疫豬抗體產(chǎn)生的規(guī)律與Apd-ELISA方法檢測(cè)的結(jié)果基本一致，兩種方法均無(wú)法區(qū)分臨床感染豬和人工免疫豬[15]；使用Apd-ELISA方法檢測(cè)330份臨床血清的陽(yáng)性率為17.88%，全菌ELISA檢測(cè)相同樣本的陽(yáng)性率為87.88%[15]，雖然全菌ELISA法的特異性普遍較差，但是，過(guò)大的差距同樣可能是Apd-ELISA法敏感性偏低造成的。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)副豬嗜血桿菌病在200—2019年的綜合患病率為27.8%[36]，本研究制備的OppA- ELISA法檢測(cè)的2 000份臨床樣本陽(yáng)性率為34.65%，其中2019年之前約為24.80%，與相關(guān)結(jié)果基本吻合。有人對(duì)Apd-ELISA與荷蘭Biocheck試劑盒（OppA- ELISA）進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果陽(yáng)性符合率僅為4.76%（6/126），反而與OppA免疫印跡法的檢測(cè)結(jié)果符合率為73.02%（92/126）[34]，考慮到本研究制備的OppA-ELISA試劑盒與Apd-ELISA試劑盒在免疫豬HPS抗體產(chǎn)生規(guī)律上的一致性，造成這種差異的原因可能是Biocheck試劑盒將臨界值設(shè)置偏高，導(dǎo)致敏感性不足所致，本研究制備的試劑盒臨界值比Biocheck試劑盒更為合理，提高了該檢測(cè)的敏感性，具有更廣的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究表達(dá)、純化3種不同的副豬嗜血桿菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體周質(zhì)底物結(jié)合蛋白，經(jīng)過(guò)篩選，選擇了OppA作為包被抗原，建立了副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒特異性和敏感性強(qiáng)，與間接血凝試驗(yàn)和進(jìn)口商業(yè)化試劑盒符合率高，可用于臨床應(yīng)用。

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Development and Application of Indirect ELISA Kits for Antibody Detection of

College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【Background】(HPS) is the pathogen of upper respiratory tract of pigs, causing Glaser’s disease, mainly in pigs before and after weaning and in the nursery stage, which is usually seen in young pigs aged 5-8 weeks, and the incidence rate is generally 10%-15%. There are 15 serotypes of the bacteria and the serotypes currently prevalent in major pig-raising countries are 4, 5, 12 and 13, and it is one of the main bacterial pathogens affecting the development of pig industry. At present, there is no commercial kit for detecting antibody of the bacteria in China.【Objective】The development of a rapid, sensitive and specific antibody detection kit could provide the technical support for the effective prevention and control of the disease.【Method】Three different periplasmic substrate binding proteins of OppA, DppA and HbpA were expressed and purified. The positive and negative serum was used to screen one of the above three proteins with sound immunoreactivity and specificity. Using the screened protein as the coating antigen, an indirect ELISA method for detecting HPS antibody was established, the reaction conditions of indirect ELISA were optimized, and the kit was assembled. On this basis, the sensitivity and specificity of the kit were evaluated; the practicability of the kit was evaluated by testing 2 000 clinical pig serum samples collected at different times and from different pig farms; based on the above clinical serum samples, 200 samples were selected randomly and tested with this kit, indirect hemagglutination test, and imported commercial kit, respectively, and the test results were compared to verify the compliance rate of the kit; finally, the kit developed in this study was used to detect immune and challenge pigs. The collected serum was used to evaluate the growth and decline of antibodies against the bacteria after immunization.【Result】Three proteins of OppA, DppA and HbpA were successfully expressed and purified, and it was found that OppA had the best immunoreactivity and specificity. After optimizing the reaction conditions, the coating concentration of OppA was determined to be 1 μg·ml-1, the blocking solution was 0.5% BSA-PBS solution, the sample dilution was 1% BSA-PBST solution, the sample incubation time was 30 min, the sample dilution was 1:50, the enzyme labeled secondary antibody incubation time was 30min, the substrate action time was 15min, and the cut-off value was 0.18; the sensitivity and specificity of the kit were 96.67%, and the kit could detect the HPS positive sera against HPS with common serotypes prevalent in China and no cross-reaction with positive sera of other common pathogens in pigs; the positive rate of 2 000 clinical serum samples was 34.65%; 200 serum samples were randomly selected, the coincidence rate with indirect hemagglutination test was 92.50%, and the coincidence rate with imported commercial kit was 87.00%; using the kit to detect the swine serum collected at different times after immunization and challenge, the HPS antibody fluctuation rule was in line with expectations.【Conclusion】The ELISA antibody detection kit fordeveloped in this study had high specificity and sensitivity, and hads a high coincidence rate with the commercial kit and indirect hemagglutination test, so it could be used for clinical HPS antibody detection and vaccine immunity evaluation.

; ABC transporter periplasmic substrate binding proteins; indirect ELISA; immunization evaluation

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.015

2021-12-13；

2022-04-24

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX(19)2020）、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（202117XX07，202117XX22）、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程專項(xiàng)資金項(xiàng)目（PAPD）

張鵬云，E-mail：zzppyy1991@163.com。通信作者范紅結(jié)，Tel：025-84399592；E-mail：fhj@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）