金桂種子休眠類型鑒定及休眠打破方法探討

焦雪輝 ，史喜兵 ，岳長平 ，申瀟瀟 ，周小娟 ，孫毅寧

（1.鄭州市農林科學研究所，河南 鄭州 450005；2.鄢陵縣東華種植農民專業合作社，河南 許昌 461200）

種子休眠的現象普遍存在于高等植物中，林木、果樹、花卉、農作物等均存在種子休眠現象。引起休眠的原因包括胚外周組織的機械、物理或化學性抑制等外在原因和胚未分化或發育未成熟、代謝抑制物等內在原因[1]。BASKIN等[2]提出了種子休眠分類系統，該系統主要包括物理休眠、形態休眠、生理休眠、復合休眠和形態生理休眠5個種類。

桂花種子存在休眠現象，一般在4月下旬至5月上旬成熟，通常需要經過6個月以上的常溫沙藏才會萌芽。前人對桂花種子休眠進行過研究。張義等[3]研究發現，低溫層積能夠促進桂花種子發芽。赤霉素浸泡與低溫層積相結合效果更好，以3000 mg/L赤霉素浸泡2 d和2000 mg/L赤霉素浸泡2 d或4 d，層積60 d效果最好，發芽率可達62.7%。許岳香[4]研究發現，胚乳的機械作用是造成美國桂花（Osmanthus americanus）種子休眠的主要原因。去種殼+赤霉素處理+赤霉素拌沙低溫層積對解除美國桂花種子的休眠最為有效，在處理后45 d能使種子的發芽率達到74%。籽銀桂的種皮和胚乳中含有抑制發芽的物質，赤霉素與低溫層積結合可以解除種子休眠，其中，以1000 mg/L赤霉素浸種，低溫層積105 d的發芽率最高，達72.37%[5]。

目前，對桂花種子休眠的研究多集中在休眠打破方法上，其中，休眠打破多以低溫層積和赤霉素浸泡為主，而從形態結構及內源物質等方面對休眠特性進行鑒定，根據休眠特性和原因探索打破休眠方法的研究不多。本試驗對金桂（Osmanthus fragransvar.thunbergii）種子種殼吸水性及內源抑制物進行了研究，并通過低溫沙藏、種殼機械處理、GA3及硝酸鑭浸泡等方法對種子進行了休眠打破，旨在揭示金桂種子的休眠類型，總結休眠打破方法，縮短播種育苗周期，為降低繁育成本提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2020年5月初，于鄭州市農林科學研究所須水試驗場采集成熟的金桂果實，去除果肉，洗凈晾干，從中挑選大小均勻、飽滿、無病蟲害的種子，用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放置于實驗室備用。

試驗中GA3購自北京中科起源科技有限公司，硝酸鑭購自阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 休眠類型鑒定試驗

1.2.1.1 種殼吸水性試驗 分別取去殼種子及劃口種子（從胚一端開始，用解剖刀向下對稱劃開種殼，至種子1/2處，露出胚但不損傷胚）各20粒，以完整種子作為對照。種子稱量初始質量（G0），放入錐形瓶中，加入30 mL蒸餾水，置于25 ℃恒溫環境中，每隔一定時間取出種子用吸水紙吸干表面水分后稱質量（Gi），重復3次，直至種子質量不再增加為止。前8 h，每浸泡2 h取一次稱質量，之后每隔12～24 h取一次。以凈吸水量隨時間的變化來表示種子的吸水率（Vi），并繪制吸水曲線。

1.2.1.2 金桂種子內源抑制物對白菜籽發芽的影響 取新鮮的種子，剝開種子并分離種殼和胚乳，分別稱取1 g，放入預冷的研缽內研碎，加入80%甲醇溶液20 mL，搖晃均勻，放入5 ℃冰箱恒溫浸提24 h，每4 h晃動一次，24 h后過濾，連續浸提3次，將3次濾液合并后倒入旋轉蒸發儀，減壓蒸干后用蒸餾水沖洗，最后定容到100 mL作為種殼和胚乳浸提液。重復3次。

挑選飽滿的白菜籽，用0.5%高錳酸鉀溶液消毒，蒸餾水沖洗凈后自然風干備用。將培養皿中放入2層濾紙，加入浸提液20 mL，放入白菜籽30粒，培養皿上覆一層保鮮膜，均勻扎孔保證透氣，放入25 ℃恒溫光照培養箱培養，期間保持濾紙濕潤。以蒸餾水培養作為對照。每個處理重復3次。48 h后統計每個培養皿中發芽的白菜籽數量，以發芽長度超過種子直徑為標準，計算平均發芽率；72 h后測量根長，記錄白菜籽生長情況。

1.2.2 休眠打破試驗

1.2.2.1 GA3質量濃度對金桂種子發芽的影響 取劃口種子30粒，分別放入質量濃度為1000、2000、3000 mg/L的GA3溶液中浸泡48 h，以蒸餾水浸泡作對照。浸泡后用蒸餾水洗凈，放入陶盆中5 ℃低溫沙藏處理60 d后取出種子，用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放入25 ℃光照培養箱培養，光照16 h、黑暗8 h。每組重復3次，連續5 d不再發芽時試驗結束，以發芽長度超過種子直徑為標準統計發芽率。

1.2.2.2 硝酸鑭質量濃度對金桂種子發芽的影響取劃口種子30粒，分別放入質量濃度為10、20、30 mg/L的硝酸鑭溶液中浸泡48 h，以蒸餾水浸泡作對照。浸泡后用蒸餾水洗凈，放入陶盆中5 ℃低溫沙藏處理60 d后取出種子，用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放入25 ℃光照培養箱培養，光照16 h、黑暗8 h。每組重復3次，連續5 d不再發芽時試驗結束，統計發芽率。

1.2.2.3 種殼處理方式對金桂種子發芽的影響 分別取完整種子、劃口種子、去殼種子各30粒，用1000 mg/L GA3溶液浸泡48 h，蒸餾水沖洗干凈后，放入陶盆中5 ℃沙藏60 d，取出種子，用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放入25 ℃光照培養箱培養，光照16 h、黑暗8 h。每組重復3次，連續5 d不再發芽時試驗結束，統計發芽率。

1.2.2.4 低溫沙藏時間對金桂種子發芽的影響取劃口種子30粒，用1000 mg/L GA3溶液浸泡48 h，蒸餾水沖洗干凈后，分別放入陶盆中5 ℃沙藏30、60、90 d，以沙藏0 d作對照。種子沙藏后用3%高錳酸鉀溶液浸泡20 min，蒸餾水沖洗3次，放入25 ℃光照培養箱培養，光照16 h、黑暗8 h。每組重復3次，連續5 d不再發芽時試驗結束，統計發芽率。

1.2.3 綜合因素對金桂種子發芽的影響 在單因素試驗基礎上，選出單因素中對休眠打破效果較好的處理進行優化，綜合幾個因素進行種子休眠打破試驗（表1）。種子在不同溶液中的浸泡時間均為48 h，消毒、培養、發芽率統計等處理同單因素試驗，每處理取30粒種子，重復3次。

表1 多因素處理方法Tab.1 Multifactor treatment method

1.3 數據分析

試驗采用Excel進行數據統計，SPSS 23.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 金桂種子休眠類型鑒定

金桂種子吸水曲線如圖1所示。

圖1 金桂種子吸水曲線Fig.1 Water absorption curve of Osmanthus fragrans var. thunbergii seeds

從圖1可以看出，去殼種子和劃口種子的最終吸水率均顯著高于完整種子。完整種子吸水率最終為26.73%，去殼種子的吸水率為37.46%，劃口種子的吸水率為35.33%。劃口種子和去殼種子前6 h為快速吸水期，吸水率迅速上升，8 h后吸水率減緩，3 d后完整種子吸水達到飽和，6 d后劃口種子吸水達到飽和。去殼種子在0～12 h，種子迅速吸水，12～48 h種子吸水率上升速度最快，6 d后吸水達到飽和。由此可以看出，金桂的種殼對種子吸水存在一定的阻礙作用。

由表2可知，培養24 h后，3種培養條件下白菜籽發芽率差異顯著，蒸餾水培養24 h后白菜籽發芽率可達到100%，種殼和胚乳浸提液培養的白菜籽發芽率均顯著低于對照（P<0.05），且胚乳浸提液培養的白菜籽發芽率顯著低于種殼浸提液（P<0.05）。48 h后白菜籽發芽率差異仍然顯著，規律與24 h時相同，種殼和胚乳浸提液培養條件下白菜籽發芽率有所升高，胚乳仍然最低，僅為57.78%。48 h后3種培養條件下根長差異顯著，蒸餾水培養條件下根長最長，達到23.50 mm，胚乳浸提液培養條件下根長最短，僅為3.47 mm。72 h后 3種培養液對白菜籽根長的影響依然差異顯著。蒸餾水培養的白菜籽根長達到47.43 mm，比48 h時增加了23.93 mm；種殼浸提液培養的白菜籽根長也有所增加，胚乳浸提液依然最短，且僅比48 h時增加了0.06 mm。由此可見，種殼和胚乳浸提液對白菜籽的萌發及根的生長有明顯的抑制作用，其中，胚乳的抑制作用更明顯，說明種 殼及胚乳中可能含有抑制種子發芽的物質。

表2 白菜籽發芽情況Tab.2 Germination of Chinese cabbage seeds

2.2 單因素處理對金桂種子休眠打破的影響

在所有處理中，金桂種子在放入培養箱第2天即開始發芽，培養15 d左右不再有新種子發芽。所有處理對種子開始發芽時間的影響差異不大。

由圖2可知，GA3質量濃度為1000、2000 mg/L時，種子的發芽率顯著高于GA33000 mg/L，也顯著高于對照（P<0.05），1000、2000 mg/L GA3間發芽率差異不顯著。其中，GA3質量濃度為1000 mg/L時種子發芽率最高，可達51.11%，而GA3質量濃度為3000 mg/L時種子發芽率僅為15.56%，與對照間差異不顯著。可見，高質量濃度的GA3可能對種子發芽有抑制作用。

圖2 GA3質量濃度對休眠打破的影響Fig.2 Effect of GA3 mass concentration on dormancy breaking

硝酸鑭質量濃度對金桂種子發芽率影響差異顯著（P<0.05），3個質量濃度條件下種子發芽率均顯著高于對照。其中，硝酸鑭30 mg/L時發芽率最高，且顯著高于其他2個質量濃度，種子發芽率可達44.44%。硝酸鑭質量濃度為20 mg/L時，種子發芽率為37.78%，顯著高于質量濃度為10 mg/L時的27.78%（圖3）。可見，硝酸鑭對種子發芽有促進作用，高質量濃度的硝酸鑭對種子發芽促進作用更明顯。

圖3 硝酸鑭質量濃度對休眠打破的影響Fig.3 Effect of lanthanum nitrate mass concentration on dormancy breaking

將金桂種子進行去殼和劃口處理后，種子發芽率顯著提高，其中，劃口種子發芽率最高，達到41.11%，與去殼種子發芽率間差異不顯著。完整種子發芽率僅為11.11%，顯著低于其他2種處理（圖4）。可見，種殼對種子發芽存在一定的機械阻礙。在試驗中觀察到，去殼種子盡管完全擺脫了種殼的機械阻礙，但其發芽率卻并非是最高的，可能是因為種子完全去殼后，胚乳直接暴露在空氣中，更容易被細菌污染，從而導致發芽率降低。

圖4 種子處理方式對休眠打破的影響Fig.4 Effect of seed treatment on dormancy breaking

在不同貯藏時間對金桂種子發芽影響試驗中，貯藏90 d后種子的發芽率最高，達到52.22%，與貯藏60 d間差異不顯著，但二者均顯著高于貯藏30 d和對照的發芽率（P<0.05）。貯藏30 d后種子發芽率為16.67%，而對照的種子發芽率僅為5.56%（圖5）。可見，低溫貯藏時間對種子發芽影響顯著，貯藏時間越長，種子發芽率越高。

圖5 低溫沙藏時間對休眠打破的影響Fig.5 Effect of low temperature sand storage time on dormancy breaking

從圖2～5還可以發現，低溫沙藏時間對種子休眠打破的影響最顯著，低溫沙藏90 d與未經過低溫沙藏的種子萌發率相差46.66百分點，而種殼處理方式中劃口種子與完整種子萌發率相差30百分點，可見，生理后熟可能是造成金桂種子休眠的主要原因，而種殼的機械阻礙可能是造成種子休眠的次要原因。

2.3 多因素處理對金桂種子休眠打破的影響

因單因素處理中金桂種子發芽率最高也僅能達到52.22%（圖5），為進一步提高種子發芽率，對單因素試驗進行優化，綜合幾個因素對金桂種子休眠打破進行試驗。從圖6可以看出，所有處理條件下種子發芽率均顯著高于對照，其中，處理1、4、5、7條件下種子發芽率均在80%以上。處理5條件下種子萌發率最高，可達87.78%，與處理1、4間差異不顯著，說明在其他因素一致的情況下，硝酸鑭質量濃度分別為40、50 mg/L時，與30 mg/L時對發芽率影響無顯著差異。在同樣濃度下，同時使用GA3和硝酸鑭處理的發芽率要遠遠高于單獨使用其中一種時的發芽率。處理1條件下種子發芽率顯著高于處理2、3，而處理2、3之間差異不顯著，說明GA3質量濃度為1000 mg/L時休眠打破效果要遠遠好于低質量濃度。處理6條件下發芽率要顯著低于處理1，說明相同條件下劃口種子休眠打破效果要顯著好于去殼種子。處理1條件下種子發芽率與處理7間差異不顯著，但二者均顯著高于處理8，說明5 ℃沙藏60、50 d對種子發芽率影響差異不大，但顯著高于40 d時發芽率，由此可見，金桂種子在低溫沙藏50 d后可能已經解除休眠了。

圖6 多因素處理對種子休眠打破的影響Fig.6 Effect of multifactor treatment on seed dormancy breaking

3 結論與討論

造成種子休眠的因素很多，主要包括環境因素，如溫度[6-7]、光照[8]等，以及種子內源因素，如種皮結構[9]、內源抑制物質[10]、種胚發育不成熟[11]、胚乳的機械阻隔[12-13]等。打破種子休眠常用的方法有種皮去除、層積處理、外源激素及化學試劑處理等，其中，外源激素打破種子休眠具有高效、便捷等優點[14]。楊秀蓮等[15]對紫梗籽銀桂種子休眠原因進行了初步探討，認為種皮和種仁中的抑制物質可能是引起種子休眠的原因，而堅硬的外種皮并不是引起休眠的原因。本研究中對金桂種殼的吸水性和內源抑制物進行了初步研究，結果發現，去掉堅硬的種殼或者在種殼上劃口處理，最終的吸水率要高于完整種子，說明金桂種子的種殼對吸水性存在一定的阻礙作用。但金桂種子的種殼比較薄，即使完整種子吸水速率也并非特別低，可以保證種子萌發對水分的需求，因此，種殼的機械阻礙并不是造成金桂種子休眠的主要原因。

種子的內源抑制物質種類具有多樣性，主要包括辛酸、棕櫚酸[16-17]、酚類、脂類、酮類[18]等，這些物質對種子萌發都有抑制作用，但作用方式和機制各不相同。施婷婷等[19]對紫梗籽銀桂果皮、種實內源抑制物進行了提取和鑒定，發現存在多種抑制物質，主要為脂肪酸類物質。本研究中利用白菜籽萌發試驗，間接證明了金桂種子中也存在抑制物質，主要抑制白菜籽根的發芽和伸長，且胚乳的抑制作用要比種殼明顯。不過，本研究所得出的抑制作用是針對白菜籽的，且浸提液未進行稀釋，濃度較高，金桂種子的內源抑制物質對其自身種子萌發是否存在抑制作用，以及抑制物濃度達到多少才會對其種子萌發產生抑制作用，還需要進一步論證。

種子由抑制物質起主要作用轉向促進物質占主導地位，是解除休眠的決定性因素[20]。休眠解除過程受多種激素控制。ABA含量與GA3/ABA值可能是解除休眠的關鍵因素[21]。種子經過層積處理后，可以減少萌發抑制物，調控種子內部激素水平向利于休眠解除的方向發展，同時能夠增加種皮的透性，促進種子生理后熟。楊秀蓮等[5]研究認為，赤霉素結合低溫層積可以有效解除桂花種子的休眠。袁王俊等[22]則研究認為，使用赤霉素和3個月層積處理不能促進桂花種子萌發，但層積3個月后進行離體培養，再在培養基中加入NAA和BA可以打破休眠，促進桂花種子萌發。本研究分別對赤霉素和低溫層積時間進行了梯度試驗，結果表明，GA3質量濃度為1000、2000 mg/L均可以提高金桂種子發芽率，且顯著高于對照和GA3質量濃度為3000 mg/L時的種子發芽率，這與楊秀蓮等[15]研究結論基本一致。低溫層積60、90 d均可以顯著提高種子發芽率，且顯著高于對照和低溫層積30 d時的發芽率，這與楊秀蓮等[15]研究結論不一致。一方面可能是試驗材料本身的差異，另一方面可能是因為層積溫度和層積容器的差異，楊秀蓮等[15]試驗中所用材料為紫梗籽銀桂，在塑料棚中2～4 ℃低溫層積，而本研究中用的是金桂，在陶盆中5 ℃低溫層積。通過試驗還發現，GA3和低溫層積處理對種子發芽的促進作用要顯著強于種殼機械處理，因此，可以斷定金桂種子應該屬于復合休眠類型，同時存在生理休眠與物理休眠。生理后熟是導致桂花種子休眠的主要因素，而種殼的機械阻礙只是次要因素。

許多研究和綜述[23]已經指出，稀土元素可促進植物生長發育，提高作物產量，提高作物淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、硝酸還原酶和酯酶等活性及土壤酶的活性，促進新陳代謝，說明稀土是一種新型的植物生長調節劑。鑭是17種稀土元素中最重要和最活潑的元素[24]。本研究利用硝酸鑭對金桂種子進行休眠打破試驗，發現其對金桂種子休眠的打破有促進作用，可能是因為稀土元素鑭對種子萌發的促進作用，鑭能夠提高種子或種芽中與生長發育相關的酶活性，從而加快大分子物質的代謝，提供種子、種芽萌發所需能量和養分，因此，促進了種子、種芽的萌發。而將硝酸鑭與赤霉素混合，同時結合低溫層積和種殼機械處理，可以進一步提早解除休眠，提高種子發芽率。GA31000 mg/L+硝酸鑭50 mg/L+5 ℃沙藏60 d+種子劃口處理組合對金桂種子休眠打破效果最好。