一年蓬葉綠體基因組特征及系統(tǒng)進化分析

周蕓蕓　郭敏　彭英權　金晨鐘　張雪嬌　胡一鴻　陳功　龔意輝

關鍵詞：一年蓬；葉綠體；基因組；結構特征；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號：S668.3 文獻標識碼：A

一年蓬[Erigeron annuus （L.） Pers.]隸屬于菊科（Asteraceae），紫菀族（Astereae），飛蓬屬（Erigeron），一年或兩年生植物，原產于北美洲，早年作為觀賞植物進入我國，現(xiàn)廣泛分布于我國[1]。一年蓬的花形似小雛菊，民間用全草或根可入藥，具有清熱解毒、消食止瀉的功效[1]。近年來有研究報道一年蓬植株提取液具有抗炎、抑菌、止血、鎮(zhèn)痛的效果[2-5]，在一年蓬水提物的研究中還發(fā)現(xiàn)其對高脂肪飲食的小鼠具有抗肥胖的作用[6]。一年蓬被認為是一種修復金屬和類金屬污染土壤的潛能植物，對Cd 和Zn 等金屬及柴油具有較好的富集和耐受效果[7-8]。然而它作為一種入侵植物，對我國農林業(yè)發(fā)展、本地物種多樣性及生態(tài)系統(tǒng)具有嚴重的影響，被我國生態(tài)環(huán)境部列入第三批外來入侵物種名單[1， 9]。目前國內外對一年蓬活性化合物[10-12]、入侵及適應機制[13-15]、防除[16-17]等方面研究較多，而有關一年蓬葉綠體全基因組特征、序列分析及其相關系統(tǒng)發(fā)育分析等尚未見報道。

葉綠體（chloroplast， CP）是為綠色植物提供能量的光合細胞器，它們在光合作用及相關代謝活動中起重要作用[18]。被子植物中典型的葉綠體基因組為雙鏈共價閉合環(huán)狀分子，具有典型的四分體結構，其中一個大單拷貝區(qū)（large single copyregion， LSC），小單拷貝區(qū)（small single copyregion， SSC），反向重復區(qū)A（inverted repeat regionA， IRA），反向重復區(qū)B（inverted repeat region B，IRB）[19]。基因組的長度一般在120～ 170 kb 之間，通常編碼110～130 個基因，約40 個基因是參與光合作用、轉錄和翻譯[20]。葉綠體基因具自我復制的特點，在大多數(shù)植物中為母系遺傳，進化過程中不經(jīng)歷重組，能直接反映植物在長期的進化過程中積累的遺傳變異，已被廣泛用于闡明物種遺傳多樣性、進化歷程、系統(tǒng)發(fā)育地位及近緣種間和種內的遺傳關系等相關研究[21-22]。隨著新一代測序技術的發(fā)展，植物基因組得到了廣泛的研究，多種菊科植物的葉綠體基因組研究都已被報道，涉及到的屬有紫菀屬（ Aster ）、向日葵屬（ Heloanthus ）、飛蓬屬（ Erigeron ）、蒿屬（ Artemisia ）、菜薊屬（ Cynara ）、萵苣屬（Lactuca）、禾葉金菀屬（Pityopsis）等[23-27]。本研究以一年蓬為試材，利用高通量測序，對組裝后的一年蓬葉綠體基因組結構、序列特征、與近緣物種序列的差異，在紫菀族族中的地位及與該屬其他植物的親緣關系等方面進行分析與研究，旨在為后續(xù)一年蓬的遺傳、系統(tǒng)發(fā)育、進化歷程及資源開發(fā)利用與防除等研究奠定分子理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料一年蓬采集于湖南省婁底市婁星區(qū)湖南人文科技學院校園內（ 27°5331"N ，111°542"E），植物樣本經(jīng)湖南人文科技學院金晨鐘、胡一鴻教授進行植物分類學鑒定。采摘一年蓬健康植株幼嫩綠色葉片，用液氮速凍后放置于–80 ℃的超低溫冰箱中，備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取與測序分析 植物全基因組DNA 用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA 提取試劑盒（DP305）提取，并通過NanoDrop2000 分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA 的質量和濃度。將高質量的DNA 樣本送南京集思慧遠生物科技有限公司進行測序，測序采用Illumina NovaSeq 6000 平臺，使用fastp0.20.0（ https：//github.com/OpenGene/fastp）軟件對原始數(shù)據(jù)進行過濾得到高質量reads，得到18 635 007 條reads（Q20 為97.49%，Q30 為93.02%）供后續(xù)組裝和注釋用。

1.2.2 葉綠體基因組組裝與注釋 從NCBI 上下載已發(fā)表的小蓬草（ Erigeron canadensis， MT806101.1）的葉綠體全基因組序列為參照，采用SPAdes[28]v3.10.1（http：//cab.spbu.ru/software/spades/）、SSPACE v2.0（https：//www.baseclear.com/sevices/bioinformatics/basetools/sspace-standard/）、Gapfillerv2.1.1[29]（https：//sourceforge. net/projects/gapfiller/）在線組裝軟件對葉綠體基因組進行組裝、校正，得到完整的一年蓬葉綠體環(huán)狀基因組序列。使用在線軟件prodigal v2.6.3（https：//www.github.com/hyattpd/Prodigal）注釋葉綠體的CDS，使用hmmer v3.1b2（http：//www.hmmer.org/）在線軟件預測rRNA，使用在線軟件aragorn v1.2.38（http：//130.235.244.92/ARA GORN/）預測tRNA，再使用blastv2.6（https：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對組裝的序列，獲得最終的注釋。將注釋完成的一年蓬葉綠體基因組序列，用在線軟件OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）制作葉綠體基因組圖譜。

1.2.3 葉 綠 體基因組特征及對比分析 使用MISA v1.0 （ MIcroSAtellite identification tool，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）在線軟件分析一年蓬葉綠體全基因組SSR 位點，利用Find repeats 工具獲得小蓬草、多舌飛蓬（E. multiradiatus）、短葶飛蓬（E. breviscapus）、香絲草（E. bonariensis）等4 種基因組的LSC 序列、SSC 序列和IR 序列，采用MAFFT 軟件[30]進行多序列比對， 最后使用RAxML v8.2.10（ https：//cme.h-its.org/exelixis/software.html ） 軟件，選用GTRGAMMA 模型，rapid Bootstrap 分析，bootstrap=1000，構建最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 一年蓬葉綠體基因組結構

一年蓬葉綠體基因組是一個典型的四分體結構，其基因組全長為153 283 bp，AT、GC 含量分別為62.95%、37.05%。其中包括大單拷貝區(qū)（LSC）84 833 bp，GC 含量為34.87%；小單拷貝區(qū)（SSC）18 412 bp，GC 含量為30.95%；反向重復區(qū)（IRa和IRb）長25 019 bp，GC 含量為42.98%（表1，圖1）。一年蓬葉綠體基因組共注釋出132 種基因，編碼蛋白質基因、tRNA 基因和rRNA 基因分別為88、36、8（表1）。

2.2 葉綠體基因的組成和特點

按照功能分類將已注釋到的這些基因分為光合作用相關基因（photosynthesis genes）、自我復制基因（self-replication genes ）、其他基因（othergenes）、未知功能基因（genes of unknown function）四大類（表2）。光合作用相關基因主要包括5 個光合系統(tǒng)I 基因（subunits of photosystem I）、15 個光合系統(tǒng) II 基因（subunits of photosystem II）、12 個NADH 脫氫酶基因（subunits of NADH dehydrogenase）、6 個細胞色素復合物編碼基因（subunits of cytochrome b/f complex）、6 個ATP合酶基因（subunits of ATP synthase）、1 個二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因（ large subunit ofrubisco）；自我復制基因主要包括11 個核糖體蛋白大亞基基因（proteins of large ribosomal subunit）、14 個核糖體小亞基基因（proteins of smallribosomal subunit）、4 個RNA 聚合酶亞基基因（subunits of RNA polymerase）、8 個rRNA 基因和36 個tRNA 基因；此外還有6 個其他功能基因及8 個未知功能基因。其中ndhB、rpl2、rpl23、rps12、rps7、rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5、trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnRACG、trnV-GAC、ycf1、ycf15 和ycf2 均含2 個拷貝基因。18 個基因含有1 個內含子，分別為ndhA、ndhB（2）、petB、petD、atpF、rps12*（2）、rps16、rpoC1、trnA-UGC（2）、trnG-UCC、trnI-GAU（2）、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC。2 個基因含有2 個內含子，分別為clpP 和ycf3。值得注意的是，本研究所注釋到8 個未知功能基因（ycf1（2）、ycf15（2）、ycf2（2）、ycf3、ycf4）仍需利用先進的分子技術手段對其功能進行鑒定。

2.3 IR 邊界的特征

使用在線網(wǎng)站IRscope（https：//irscope. shinyapps.io/irapp/）繪制對比圖，比較一年蓬與多舌飛蓬（E. multiradiatus）、香絲草（E. bonariensis）、短莛飛蓬（E. breviscapus）、小蓬草（E. canadensis）4 個物種的LSC、SSC 和IR 區(qū)的邊界位置（圖2），這5 個菊科物種葉綠體基因組4 個區(qū)域中，IR 區(qū)較為保守，其片段大小為24 326～25 019 bp。rps19基因位于LSC/IRb 區(qū)域中，其中一年蓬、香絲草、短莛飛蓬和小蓬草中LSC 和IRb 區(qū)向擴張程度相同，均為217、62 bp，多舌飛蓬在LSC 和IRb 區(qū)向擴張分別為212、67 bp。這5 種植物中的rpl2基因均位于IR 區(qū)域內。一年蓬中的tmN 基因位于IRa 區(qū)域內，而多舌飛蓬、香絲草、短莛飛蓬和小蓬草中位于IRb 區(qū)域內；一年蓬存在2 個ycf1基因，分別在SSC/IRb 邊界擴張，距離JSB 邊界567、12 bp，SSC/IRa 邊界區(qū)域中擴張，距離JSA邊界分別為4482 bp 和15 bp，而其他4 種植物只存在1 個ycf1 基因；SSC/IRb 邊界顯示，一年蓬、多舌飛蓬、短莛飛蓬和小蓬草中的ndhF 基因全部在SSC 區(qū)域內擴張，而香絲草并沒有檢測到ndhF基因。這5 種植物中的tmH 基因全部在LSC 區(qū)域內擴張。

2.4 葉綠體基因組SSR 位點分析

使用MISAv1.0（http：//pgrc.ipk-gater-sleben.de/misa/misa.html）在線軟件對一年蓬葉綠體基因組進行重復單元（SSR）位點分析（圖3）。共在一年蓬葉綠體基因組中查找到200 個符合條件的SSR 位點，分布在LSC、SSC、IR 區(qū)域的SSR 數(shù)量分別為126、40、34 個，分別占總SSR 位點數(shù)比重為63%、20%、17%。單核苷酸重復單元共139 個，主要以A 和T 為主，雙核苷酸重復單元20 個，主要以AT 和TA 為主，三核苷酸重復單元106 個，主要以TTA、TAA 和TAT 為主。四核苷酸重復單元13 個，主要以TATT 和 TTAT 為主，五核苷酸重復單元3 個，分別為TACTA、TATAT、TTAGA。說明一年蓬葉綠體基因組中A/T 堿基占優(yōu)勢，具有堿基偏好性。這與該物種中AT 含量占62.95%的結果相一致。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將一年蓬與菊科管狀花亞科紫菀族21 種植物葉綠體基因組序列，以舌狀花亞科苦荬菜屬植物苦荬菜（Ixeris polycephala）為外群構建發(fā)育樹（圖4）。進化樹結果顯示，一年蓬與一枝黃花（Solidago decurrens）、鉆葉紫菀（Symphyotrichumsubulatum）、多舌飛蓬、短莛飛蓬、香絲草、小蓬草、瓶頭草（Lagenophora cuchumatanica）聚在一個分支上，紫菀屬植物聚類在另外一支。從飛蓬屬的5 個物種的親緣關系來看，一年蓬與同屬的小篷草（MT806101.1）聚在一起，形成2 個姊妹類群。

3 討論

葉綠體細胞器參與高等植物光合作用和碳固定等生理活動，是承擔能量轉換的重要細胞器[31]。葉綠體基因組是植物細胞內3 種基因組中最為保守的一類，具有高度的保守性和較慢的進化速率，在不同物種間的系統(tǒng)進化研究中有更好的統(tǒng)一性[32]。植物葉綠體基因組長度一般為107～218 kb，不同物種之間長度略有不同，其長度的變化主要是由IR 區(qū)的收縮和擴張導致[33]。本研究所獲得的一年蓬葉綠體基因組大小與結構與已報道的被子植物研究結果相符。一年蓬葉綠體基因組是一個典型的四分體結構，全長為153 283 bp，與同屬植物小蓬草（ 152 721 bp ）、多舌飛蓬（152 281 bp）、短葶飛蓬（152 357 bp）、香絲草（153 014 bp）差異小，與已報道的菊科植物葉綠體基因組長度（149.51～153.20 kb）相比較，一年蓬及其所屬的飛蓬屬植物葉綠體基因組長度較長[23-34]。一年蓬葉綠體基因組中AT、GC 含量分別為62.95%、37.05%，其中反向重復區(qū)（IRs）中GC 含量達到最高（42.98%），這與其他菊科植物葉綠體基因組特征一致[25]。一年蓬基因組大單拷貝區(qū)（LSC）84 833 bp，小單拷貝區(qū)（SSC）18 412 bp，反向重復區(qū)（IRs）25 019 bp，與多舌飛蓬（AT：62.90%、GC：37.10%；LSC：84 881 bp、SSC：18 102 bp、IRs：24 692 bp）、短葶飛蓬（AT：62.80%、GC：37.20%；LSC：84 789 bp、SSC：18 110 bp、IRs：24 691 bp）遺傳差異很小，主要差異在SSC 和IRs 區(qū)域，相差300 bp 左右[35]。通過IRscope 比較分析，發(fā)現(xiàn)飛蓬屬的幾個物種葉綠體基因組結構和大小高度保守，但是SC 和IR邊界仍會有細微區(qū)別。這與蘇玥等[36]對乳苣葉綠體基因組特征研究結果一致，乳苣與其他5 種菊科近緣種植物葉綠體基因組進行比較分析時發(fā)現(xiàn)基因組序列整體高度相似，但是在rps19、rpl2、ycf1、trnN、ndhF、trnH 和rpl23 等基因上有變化。

一年蓬葉綠體基因組共注釋出132 種基因，其中編碼蛋白質基因、tRNA 基因和rRNA 基因數(shù)量分別為88、36、8 個。梁鳳萍等[23]對27 種菊科植物葉綠體基因組進行注釋，發(fā)現(xiàn)菊科植物葉綠體基因組共有基因一般為125～138 個，編碼蛋白基因為83～90 個，tRNA 基因32～43 個，rRNA基因7～9 個。同屬多舌飛蓬和短葶飛蓬葉綠體基因組共注釋129 個基因，編碼蛋白質基因84 個、tRNA 基因37 個和rRNA 基因8 個[35]。一年蓬葉綠體基因組基因數(shù)目特征與其他菊科植物一致，值得提出的是本研究注釋到8 個未知功能基因[ycf1（2）、ycf15（2）、ycf2（2）、ycf3、ycf4]，需進一步利用先進的分子技術手段對其功能進行鑒定。

葉綠體SSR（cp SSR）通常是短的單核苷酸串聯(lián)重復序列，當位于線粒體基因組的非編碼區(qū)域時，通常顯示種內變異重復次數(shù)[37]。cp SSR 可以在同一物種內表現(xiàn)出高度變異，被廣泛應用于群體遺傳學和系統(tǒng)發(fā)育分析等領域[38-39]。在一年蓬葉綠體基因組LSC、SSC、IR 區(qū)域的SSR 數(shù)量分別為126、40、34 個，單核苷酸重復單元最多，其次是三核苷酸重復單元，A/T 堿基占優(yōu)勢，在菊科[40-41]和其他植物科[42-43]中研究結果一致。這些SSR 可為飛蓬屬物種分子標記開發(fā)及物種鑒定提供理論依據(jù)。

隨著葉綠體基因組測序數(shù)量的增加，很多學者通過該類基因組重建了菊科植物的系統(tǒng)發(fā)育關系。本研究在NCBI 上下載了22 種紫菀族植物，以舌狀花亞科苦荬菜屬植物苦荬菜為外群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。一年蓬在內的飛蓬屬與聯(lián)毛紫菀屬、一枝黃花屬和瓶頭草屬的植物聚類在一個分支上，紫菀屬植物另聚類為一支。這與基于ITS 等分子標記建立的分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示的小蓬草與飛蓬屬、一枝黃花屬等構成一個分支的結果一致[44]。一年蓬與同屬小蓬草聚在一起，認為基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)，同屬植物的親緣關系最近。本研究對一年蓬綠體基因組基因結構、SSRs 數(shù)量及分布和基因功能等進行了分析，結合已公布的紫菀族族物種葉綠體基因組序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，闡明了一年蓬和紫菀族不同物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，豐富了菊科植物的進化關系，為植物分類、遺傳進化、系統(tǒng)發(fā)育及一年蓬的開發(fā)和防除等研究奠定了分子基礎。