姬松茸粗多糖防治煙草花葉病毒病

胡疊　唐前君　羅坤　吳秋云　夏志蘭　劉敏

關鍵詞：姬松茸；粗多糖；煙草花葉病毒；半葉法

中圖分類號：S435.72 文獻標識碼：A

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）為單鏈正義RNA 病毒，經接種鑒定統計其寄主多達350 多種植物，除煙草外，還為害多種經濟作物，例如茄科、十字花科等[1]。生產中病毒粒子的擴散和流行速度受溫度、濕度、光照的影響，在高溫和強光環境下病毒延長潛育期，一旦條件適宜再爆發病癥。全國各煙區均有因煙草花葉病造成減產的問題，尤其是云南、貴州煙區主要受TMV 影響，平均發病率為20%～30%，嚴重年份高達60%～80%，導致毀田和絕收[2]。

天然真菌多糖主要分布在大型真菌子實體和菌絲中，多個單糖（10 個以上）以糖苷鍵連接組合成螺旋狀高分子多聚物[3]，結構形態近似于DNA，具有特殊生物活性[4]。經過深入研究，研究人員發現一些真菌中含有多種農用活性物質[5]。真菌多糖在抑制病菌和病毒、殺線蟲、防治害蟲等方面有良好的效果，已經在香菇屬（Lentinus）、蠟傘屬（Hygrophorus）、杯傘屬（Clitocybe）和牛肝菌（Boletus）等菌類中均有發現[6-8]。張超等[9-10]以平菇、香菇和金針菇子實體為材料，從中提取的多糖在枯斑寄主莧色藜上對TMV 表現出不等的抑制作用。許玉娟等[10]發現經蒼耳多糖處理后的心葉煙，在接種TMV 后，枯斑明顯少于對照組，有效抑制了TMV 浸染，推測蒼耳多糖誘導植株防御酶活性從而抑制病毒。吳艷兵等[11]從體外鈍化、預防、治療三方面評價了毛頭鬼傘多糖對TMV 的抑制效果，發現毛頭鬼傘多糖具有較強的預防侵染作用，可有效預防TMV病毒病的發生。香菇多糖為現市面具代表性的真菌多糖農藥產品，共登記44 個產品信息，以0.5%～2.0%水劑為主，具有殺菌和植物抗性誘導作用。趙新保[12]研究表明，0.5%香菇多糖水劑用量為18.75～26.25 g/hm² 時，辣椒病毒病防效可達62.0%～66.5%，并且該藥劑在有效濃度范圍內對作物和環境安全。

隨著社會經濟的快速發展以及生活水平的不斷提高，食品安全意識也逐漸加強，因此農業生產中綠色防控技術的需求增加。真菌多糖是真菌的代謝產物，天然且安全，殘留在環境中也會被微生物分解，不造成污染。真菌多糖可誘導植物提高抗病性、激發植物免疫力，可以開發成農業生產上新型的植物抗病誘導劑，具有非常好的應用前景。本研究在提取6 種真菌多糖粗品的基礎上，采用半葉法和綠色熒光標記技術，篩選出抗TMV 效果最好的多糖，研究結果對作物TMV 的綠色防控具有一定的理論意義和實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病毒 煙草花葉病毒（Tobacco mosaicvirus， TMV），由湖南農業大學植物保護學院植物病理學系唐前君老師提供。

1.1.2 供試作物 心葉煙（Nicotiana glutinosa）、普通煙NC-89（N. tabacum var. NC89）、本氏煙（N. benthamiana）、云煙87（N. Yunyan 87），由湖南農業大學植物保護學院植物病理學系唐前君老師提供。

1.1.3 供試藥劑 0.5%香菇多糖水劑，市購，山東圣鵬科技股份有限公司生產；1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑，市購，河南神華藥業有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 煙草花葉病毒（TMV）懸浮液制備 取感染病毒的葉片（云煙87）樣品100 g，剪碎置于研缽內，加入少許石英石和20 mL 預冷磷酸緩沖液（0.2 mmol/L， pH 5.7～8.0），充分研磨，過濾；磷酸緩沖液定容至100 mL，制得煙草花葉病毒懸浮液，置于4 ℃備用。

1.2.2 真菌粗多糖制備 試驗使用6 種真菌子實體，包括平菇（Pleurotus ostreatus）、姬松茸（Agaricus blazei）、云芝（Coriolus versicolor）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、靈芝（Ganodermalucidum）、桑黃（Phellinus igniarius），粗多糖提取步驟如下[13-15]：（1）在干燥箱37 ℃條件下干燥24 h，將子實體徹底烘干；（2）上述烘干后的子實體各取150 g，利用中藥小型粉碎機打成細粉，按照水料質量比15∶1，各子實體粉末中加入去離子水，95 ℃水浴6 h 后過濾，濾渣重復水提一次，收集最終濾液，經4000 r/min 高速離心15 min 去除沉淀、循環真空水泵抽濾3 次，獲得無明顯顆粒雜質的濾液，60 ℃ 下旋轉蒸發儀20 r/min 將濾液真空濃縮至原體積的1/5；（3）按體積比1∶1，將配好的sevage 工作試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）加入濃縮濾液中，震蕩30 min后，經4000 r/min 高速離心15 min，保留上層多糖溶液，去除下層含蛋白質的溶液，重復離心至下層溶液完全去除干凈；（4）加入4 倍體積的95%乙醇，與濃縮液充分混合，置于4 ℃冰箱靜置21 h，經4000 r/min 高速離心15 min，收集沉淀，加入少量去離子水復溶沉淀，再次醇沉，收集所有沉淀置于37 ℃烘箱放置1 h，除去殘留的乙醇溶液，然后經過冷凍干燥儀凍干，得到子實體粗多糖。

1.2.3 多糖理化性質測定 多糖化學組成測定包括總糖、蛋白質、糖醛酸、硫酸基含量。采用苯酚硫酸法測定總糖含量[16]；采用考馬斯亮藍測定蛋白質含量[17]；采用硫化鋇-明膠法測定硫酸基含量[18]；采用間羥基聯苯法測定多糖糖醛酸含量[19]。

1.2.4 抗TMV 粗多糖篩選 藥效測定參照陳年春[20]、逄麗麗等[21]的半葉法。

（1）粗多糖對TMV 的鈍化作用。選取7 葉期長勢一致的心葉煙，TMV 病毒粒子為接種物（按1∶100 稀釋），利用去離子水將粗多糖分別稀釋至6、12、24 mg/mL，病毒分別與多糖溶液1∶1 混合，靜置30 min，采用半葉法摩擦接種到心葉煙的左半葉，右半葉接種去離子水與病毒混合液作對照。每個處理3 株，重復3 次。將處理后的葉片置于25～28 ℃、濕度70%～80%的條件下5～6 d。記錄形成的枯斑數，根據公式計算鈍化率，評定真菌多糖對TMV 的鈍化效果。

式中，C 表示空白對照組的枯斑數量；T 表示處理組的枯斑數量。

（2）粗多糖對TMV 的預防作用。將稀釋為6、12、24 mg/mL 的粗多糖溶液分別噴施到心葉煙葉片半葉，另半片葉噴去離子水作對照，連續處理3 d。在最后一次噴施24、48 h 后，分別對各處理的葉片全葉接種病毒。然后置于溫室中培養5～6 d。記錄形成的枯斑數，根據公式計算預防率，評定真菌多糖對TMV 的防御效果。

式中，C 表示空白對照組的枯斑數量；T 表示處理組的枯斑數量。

（3）粗多糖對TMV 的治療作用。將供試病毒摩擦接種到7 葉期的心葉煙葉片，分別在24、48 h 后，將粗多糖溶液分別噴施到心葉煙葉片半葉，另半片葉噴去離子水作對照，連續處理3 d。培養5～6 d 記錄形成的枯斑數，根據公式計算抑制率，評定粗多糖對TMV 的治療效果。抑制率計算公式如下：

式中，C 表示空白對照組的枯斑數量；T 表示處理組的枯斑數量。

1.2.5 五點注射法 由本實驗室保存的TMVGFP農桿菌菌株，在含有50 μg/mL Kana 和25 μg/mL Rif LB 液體培養基中，28 ℃ 180 r/min條件下培養24 h。5000 r/min 室溫離心10 min，吸取上清液保留沉淀，加入5 mL 侵染液將菌體沉淀重懸，直至菌液OD600 為0.8 左右。28 ℃90 r/min 誘導4 h。侵染液配置見表1。

選取培養1個月左右，生長狀況良好、長勢一致的本氏煙草，用一次性注射器吸取藥劑，避開葉片主脈、次脈選取5 個點，使藥劑連成環注射煙草葉片背面。用去離子水作對照，3次重復。24 h 后，在藥環的中心注射制備的TMV-GFP 農桿菌菌液，黑暗培養12 h，光照培養2、5 d 后紫外燈照射，每天觀察熒光斑點擴散情況。采用十字交叉法測定熒光斑直徑，計算抑制率。

1.2.6 抗病粗多糖對系統寄主防效測定 將對TMV 防治效果較好的粗多糖稀釋為6、12、24、48 mg/mL， 分別噴施5～7 葉期且長勢一致的NC-89 煙草上，48 h 后接種病毒，各處理40 株，重復3 次。以清水為陰性對照，1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑（60 mg/L）為陽性對照1，0.5%香菇多糖水劑（26.25 mg/mL）為陽性對照2。處理后煙草置于防蟲溫室培養，待陰性對照煙苗明顯發病后記錄各處理組的發病情況。

按照病葉級數，計算各處理的病情指數。煙草病情分級標準及公式[22]如下：0 級為全株無病；1 級為新葉明脈，少數葉片輕花葉；3 級為全株1/2 葉片花葉，少數葉片變形或葉脈變黑；5 級為全株2/3 葉片花葉或有小枯斑，植株矮化，株高為健株1/2，結果少；7 級為全株葉片花葉或葉片枯斑連片枯死，植株嚴重矮化，不結果或結果畸形。

1.2.7 抗病粗多糖對TMV的大田防效測定 選取長勢一致的煙草共42 行，每行40 株，自然發病，第1～6 行噴施0.5%香菇多糖水劑（26.25 mg/mL），7～12 行噴施1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑（60 mg/L），13～18 行噴施清水，19～24、25～30、31～36、37～42行分別噴施6、12、24、48 mg/mL 姬松茸粗多糖水溶液，每7 d 噴1 次，共噴3 次，試驗期間不使用其他藥劑，病葉級數標準及公式參照1.2.6。

1.3 數據處理

以各試驗組防治效果數據為基礎數據，采用Microsoft 365 Excel 軟件進行數據整理并計算平均值、標準差和繪制圖表；采用IBM SPSS Statistics19.0 軟件進行顯著性檢驗和Pearsons 相關系數分析。

2 結果與分析

2.1 6 種食用菌的粗多糖組分含量

經測定，6 種食用菌多糖中，姬松茸粗多糖提取率最高，達24.32%，其次為平菇18.56%， 最低為杏鮑菇（表2）。總糖含量中，姬松茸總糖顯著高于其他食用菌種類，達到37.71%，其次是桑黃和靈芝粗多糖總糖含量，均超過32.00%。云芝粗多糖的糖醛酸含量為6.81%，顯著高于其他5種食用菌粗多糖，其次是靈芝粗多糖。姬松茸粗多糖硫酸基含量高達2.10%，已有研究表明，硫酸基含量影響多糖的許多生物活性功能[23]。

2.2 抗TMV 病毒的粗多糖篩選

通過半葉法測定粗多糖的藥效，結果如表3所示，6 種食用菌粗多糖對TMV 均具有一定的防治效果。均以噴施多糖溶液48 h 后接種病毒的預防效果最好，姬松茸、云芝、平菇粗多糖的預防率可達到60.00%以上， 尤其姬松茸粗多糖24 mg/mL 處理的預防效果最好，高達92.04%；其次是12 mg/mL 姬松茸粗多糖的預防率為86.91%。6 種食用菌粗多糖對TMV 的治療效果不明顯，除了接種病毒24 h 后噴施24 mg/mL 姬松茸粗多糖的治療效果可達到44.53%以外，其余處理的預防效果均低于42.00%。食用菌多糖對TMV 的鈍化效果比預防效果差，除24 mg/mL 平菇粗多糖處理組鈍化率為62.41%，其他均低于60.00%。不同時間姬松茸粗多糖處理葉片對TMV 的預防效果存在差異，處理48 h 后葉片的預防效果優于處理24 h 后。粗多糖的使用濃度和處理方式對防治效果均有一定影響，部分粗多糖在相同濃度不同施藥方式下對病毒的抑制效果不同，此外，相同施藥方式的抑制效果也并未隨施藥濃度的增加而提高。

2.3 綠色熒光蛋白標記試驗

將24 mg/mL 姬松茸粗多糖按照五點注射法流程處理煙草，黑暗培養12 h 后注射點綠色熒光蛋白的表達隨著時間的推進，熒光點的大小、強弱均發生變化（圖1A，圖1D），這間接反映了病毒的分布、擴散和增殖情況。在光照培養2 d后， 粗多糖處理組的熒光斑直徑（ 平均直徑0.83 cm）明顯小于去離子水對照組（平均直徑1.18 cm），抑制率為29.66%（圖1B，圖1E）。并且光照培養5 d 時，粗多糖處理后的熒光斑點亮度弱于對照組（圖1C，圖1F），說明其在病毒侵染前期對TMV 的增殖有抑制作用，明顯可看出對照組熒光區域進一步擴大（ 平均直徑1.65 cm），熒光點開始明顯向葉片其他區域移動，新葉上發現少量熒光點，光照培養5 d，粗多糖處理組（平均直徑1.02 cm）與光照培養2 d 時相比，熒光區域變化不大且新葉未出現熒光點，抑制率為38.18%。表明姬松茸粗多糖延緩了TMV 的移動速度，減緩系統侵染進程。

2.4 姬松茸粗多糖對系統寄主的防效

姬松茸粗多糖在系統寄主NC-89 上對TMV有一定的防治效果（表4）。與對照相比，處理組煙苗的病情指數明顯降低，6、12、24 mg/mL姬松茸粗多糖對病毒的相對防效均在52.00%以上，在48 mg/mL 濃度時植株出現損傷，多糖濃度過高在植株表面形成沉淀，引起植株黃化。當粗多糖濃度為24 mg/mL 時，對TMV 的防治效果高達76.81%，其防治效果略高于0.5%香菇多糖水劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑處理組。姬松茸多糖能有效防治TMV，延遲植株發病，有利于煙草的生長。

2.5 姬松茸粗多糖對TMV 的大田防效試驗

在發病煙草田中第3 次噴灑24 mg/mL 姬松茸粗多糖溶液后7 d，對TMV的防治效果為70.31%，略低于0.5%香菇多糖水劑和1.8%辛菌胺醋酸鹽水劑處理組（表5）。48 mg/mL 姬松茸粗多糖溶液在第2 次施藥后，植株出現黃化，局部葉片壞死的情況。姬松茸粗多糖對TMV 的防治效果十分顯著，對葉片扭曲、卷縮、停止生長的植株有明顯改善，病情指數低的植株完全能夠恢復正常。同時對TMV 有一定的抑制作用，噴施過姬松茸粗多糖的煙草發病時間延后，煙草長勢良好，葉片伸展，而噴施清水的植株明顯矮化，葉片發黃。

3 討論

已有研究得出糖醛酸含量較高的多糖具有某些特殊生理活性，一般高含量糖醛酸多糖大多出現在植物類多糖中[24]。本研究得出，云芝粗多糖的糖醛酸含量為6.81%，顯著高于其他5 種食用菌多糖，高于劉瑋[25]研究的糖醛酸含量，其原因可能是原材料的品種、產地及栽培方式不同導致的。硫酸基含量指多糖結構中所帶的硫酸基的個數，本研究測得姬松茸粗多糖硫酸基含量高達2.10%，施婭楠等[23]研究得出，多糖的許多生物活性功能與硫酸基含量有直接關系，導致多糖的抗氧化性存在差異，進而可能影響其抗病毒或抑菌能力。如BACH 等[26]通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法、2，2′-聯氮雙-二胺鹽（ABTS）法測定不同真菌提取物的抗氧化能力，觀察到DHHP 法中的抗自由基活性依次為：巴西蘑菇>雙孢蘑菇>香菇>金針菇，ABTS 法中依次為：巴西磨菇>雙孢蘑菇>金針菇>香菇。

煙草花葉病毒（TMV）依賴寄主提供的場所、底物和酶等一系列物質在寄主活細胞內進行自我復制和裝配[26-28]。真菌多糖不僅能針對病毒粒子，也能作用于寄主植株，誘發寄主抗病性[29]。真菌多糖對煙草花葉病有一定的抑制作用，噴施多糖溶液48 h 后接種TMV 的預防效果較好，姬松茸、云芝、平菇粗多糖的預防效果均達到60.00%以上。尤其是24 mg/mL 姬松茸粗多糖處理的預防效果最好，高達92.04%。從總體來看，真菌多糖對TMV 的預防效果較好，與沈小英等[30]的研究結果一致，其他報道的掃把菌、奶漿菌、安絡小皮傘和火碳菌等多糖對TMV 的防治效果超過80%[31]。從產品的生產成本來看，人工種植菌株更有優勢。

室內試驗表明，姬松茸粗多糖的防治效果稍優于香菇多糖，而大田試驗防效略低，與標準農藥產品相比，由于技術上的差異，姬松茸多糖水溶液的穩定性和純度不夠。施藥方式不同，姬松茸多糖均能相應緩解植株的病情，但防治效果有差異，這可能與姬松茸多糖的作用方式有多指向性，既能切斷病毒與細胞的結合，還能抑制病毒復制，或保護寄主植株有關。