基于免疫檢查點抗體藥物的分子探針的應用

陶金萍，黃海峰，楊 志，朱 華

1. 北京大學腫瘤醫院核醫學部腫瘤發生與轉化研究教育部重點實驗室（北京），放射性藥物研究與評價重點實驗室（國家藥品監督管理局），北京 100142；

2. 貴州大學醫學院，貴州 貴陽 550025；

3. 貴州省人民醫院骨科，貴州 貴陽 550002

惡性腫瘤是中國人口主要的死亡原因。腫瘤治療方式主要包括化療、放療、手術治療、免疫治療、靶向治療和內分泌治療。免疫治療是通過提高免疫細胞識別能力和消除攜帶特異性抗原的腫瘤細胞來刺激機體增強自身免疫能力，從而提高抗腫瘤效果［1］。近幾年，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）療法成為腫瘤免疫治療中備受關注的研究方向，免疫檢查點分子是位于免疫細胞表面的受體，與配體結合后，通過傳遞抑制或刺激信號在調節免疫反應和維持自我耐受性中發揮功能性作用［2］。程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）是目前研究尤為廣泛的免疫檢查點，已經在黑色素瘤、腎癌和肺癌中獲得了持久的應答。然而，能從中受益的患者有限且應答率低，甚至一些患者可能經歷嚴重的免疫相關不良事件［3］。這就為發現新的免疫檢查點提供了動力，T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM3）、淋巴細胞活化基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）、T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域（T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT）等的發現，將有助于提高免疫細胞的抗腫瘤作用和患者的臨床反應性。放射性標記的ICI分子成像能突破免疫組織化學在反映腫瘤組織中生物標志物的異質性和時空動態表達中的局限。分子成像技術有助于對免疫腫瘤學治療進行動態評估、顯示示蹤劑在體內的分布情況［4］。

1 分子成像在ICI治療中的應用

免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）是確定惡性病變中程序性死亡受體配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）表達水平的金標準，但臨床診斷迫切需要一種非侵入性成像策略來彌補IHC的缺點。分子成像技術可以解決免疫檢查點蛋白在腫瘤中的異質性表達問題，允許重復采集圖像，有利于疾病進展和干預期間的監測，同時也避免重復活檢，極大地減輕患者的痛苦［5］。放射性示蹤劑可清楚顯示免疫檢查點在體內的分布情況，在腫瘤的免疫治療過程中發揮指導作用（圖1）。

圖1 ICI抗腫瘤作用機制圖

傳統的正電子發射體層成像（positron emission tomography，PET）示蹤劑，如18F-FDG，已經在臨床上得到充分的研究，其為葡萄糖代謝顯像劑，對于腫瘤細胞種類的特異性鑒別診斷能力不足，對于免疫T細胞并無特異性［6-7］。放射性標記的抗體藥物在各種惡性腫瘤的臨床前研究中已經展示出巨大的潛力，部分抗體示蹤劑已成功地完成臨床研究。本文將介紹靶向不同免疫檢查點的放射性抗體示蹤劑的臨床前和臨床研究動態及進展（表1）。

表1 特異性靶向免疫檢查點抗體探針的研究

續表

2 靶向PD-1的放射性示蹤劑

PD-1在T細胞、B細胞和自然殺傷細胞表面表達，與其天然配體PD-1結合會抑制T細胞的活性，因此抑制PD-1與PD-L1之間的相互作用可促進免疫應答［17］。

針對PD-1的單克隆抗體，已在臨床前研究和臨床試驗中進行了測試，在腫瘤診斷和治療方面取得了令人鼓舞的結果。2015年，Natarajan等［10］首次報道了一種64Cu放射性標記的抗體示蹤劑，用于阻斷PD-1與PD-L1結合，并利用PET技術評估體內腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）上PD-1的表達。2016年，Hettich等［21］使用64Cu放射性標記的抗體示蹤劑在動物淋巴結中實現了無創可視化PD-1和PD-L1。這兩項研究證明了靶向PD-1和PD-L1的單抗探針在免疫活性小鼠中的成像實驗的特異性，進一步推進了PD-1/PD-L1阻斷藥物的臨床前和臨床開發。但僅限于小鼠體內PD-1的研究并不能解決腫瘤治療藥物研發中人類面臨的臨床困境。因此，PD-1表達的研究需要新的放射性探針和模型，而人源化模型更能模擬人類的生理和病理狀態，后續工作也證明基于人源化模型的研究［58］進一步推動了免疫檢查點免疫療法的臨床前研究。

基于抗體示蹤劑的藥代動力學特征，臨床研究選用半衰期較長的89Zr放射性核素標記。一項在13例非小細胞肺癌患者中的研究［18］表明，89Zr-納武單抗在對該藥物治療有反應的腫瘤病變中攝取較高，且腫瘤病灶的攝取在患者之間和患者內部差異均有統計學意義。另一項研究［13］招募了11例轉移性黑色素瘤患者，7例轉移性非小細胞肺癌患者，證明89Zr-派姆單抗攝取與患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）相關，但其中1例患者在開始接受派姆單抗治療后因一系列不良反應而死亡。可見盡管這些療法在一些患者中具有較好的治療效果，但其引起的不良反應也可能是致命的。因此，對PD-1治療受益者進行篩查，有利于確定最佳的給藥策略。

3 靶向PD-L1的放射性示蹤劑

由于能從PD-1/PD-L1的特異性單克隆抗體療法受益的患者只有20%［29］，且單克隆抗體相對分子質量較大，腫瘤穿透性能較差。因此，需要開發新的探針來指導患者選擇藥物，提高腫瘤對探針的攝取能力。針對PD-L1的抗體已在腎細胞癌、非小細胞肺癌和晚期黑色素瘤等腫瘤中顯示出抗腫瘤活性。其中從多樣性Fab噬菌體展示文庫中分離出的多個抗PD-L1抗體經研究［22，24］證明其具備腫瘤PET和免疫治療的抗體治療劑的潛力。后續多種抗小鼠和抗人單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）［26，28，31］顯示出較高的檢測能力。然而，這些研究是在具有不同免疫能力的小鼠中進行的，這限制了示蹤劑在特異性方面的驗證。

一些已經獲得美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的PD-L1檢查點抑制劑，在多種惡性腫瘤的治療中顯示出令人鼓舞的結果。2018年，Bensch等［35］使用89Zr-阿替利珠單抗進行了首次臨床研究，膀胱癌、三陰性乳腺癌和非小細胞肺癌患者的客觀緩解率分別為56%、25%和11%，證實腫瘤攝取89Zr-阿替利珠單抗探針與最佳腫瘤緩解類別之間存在正相關，也與病變大小相關。另一項研究［32］利用阿替利珠單抗合成示蹤劑，檢測了111In PD-L1-單克隆抗體和NIR-PD-L1-單克隆抗體在多種腫瘤模型中的特異性，單光子發射計算機體層成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）顯示用111In PDL1-單克隆抗體成像的最佳時間為120 h。除了阿替利珠單抗，阿維魯單抗是一種新出現的用于靶向PD-L1的人IgG1單克隆抗體，已經在肺腺癌模型中針對PD-L1的近紅外光免疫療法進行了測試［59］。近期幾項臨床前研究［5，23］通過89Zr標記的阿維魯單抗不僅證實了用89Zr-Df-阿維魯單抗靶向PD-L1的免疫PET的可行性，還證明其可用于指導乳腺癌患者的分層、治療監測和反應預測。

Xing等［37］通過99mTc-NM-01探針在16例經組織病理學檢查證實的非小細胞肺癌患者體內進行了靶向PD-L1非侵入性成像的Ⅰ期臨床研究，結果顯示腫瘤血池比與PD-L1表達之間具有相關性，同時確定了非小細胞肺癌患者可耐受的輻射劑量。近期，有研究者在頭頸部鱗狀細胞癌中開展了度伐利尤單抗的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗，Verhoeff等［38］通過89Zr-DFO-度伐利尤單抗探針靶向PD-L1，評估了該探針PET的安全性和可行性，并預測度伐利尤單抗治療期間的疾病控制率。

4 靶向CTLA-4的分子成像

CTLA-4是在細胞毒性T淋巴細胞上表達的關鍵抑制性受體。伊匹單抗是一種針對CTLA-4的單克隆抗體，用于治療晚期黑色素瘤。除了一項研究［51］探討了64Cu標記的伊匹單抗在小鼠非小細胞肺癌模型中的生物分布，Ehlerding等［52］比較了伊匹單抗全抗體和伊匹單抗的F（ab’）2片段，用64Cu放射性標記，并在人源化小鼠模型中驗證，研究發現伊匹單抗全抗體在靶器官中有更高的絕對攝取，而伊匹單抗的F（ab’）2片段允許在更早的時間點進行更高對比度的成像，但絕對攝取值更低。在此之前，Higashikawa等［50］開發了一種64Cu-抗-CTLA-4抗體探針，用于CT-26移植瘤小鼠中表達CTLA-4的TIL成像。目前，一項臨床試驗（NCT03313323）［60］也正在研究使用89Zr-伊匹單抗作為治療中的預測生物標志物的CTLA-4成像。使用抗CTLA-4的免疫療法在臨床實踐中取得了一定的成功，但CTLA-4的配體CD80和CD86也在抗原呈遞細胞（antigenpresenting cell，APC）上表達，阻斷CTLA-4具有不僅限于腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）的全身性影響。因此，抗CTLA-4免疫療法仍存在與抗CTLA-4給藥相關的自身免疫或其他嚴重不良事件的潛在風險。

5 靶向TIM3的分子成像

TIM3最初被確定為一種在活化的效應T細胞上表達的起負調控作用的表面分子，進一步研究發現TIM3也在先天免疫細胞上表達，包括單核細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞［1］。有研究［61］發現，TIM3表達的增加與對抗PD-1療法的適應性抗性有關。

目前，關于靶向TIM3的體內成像示蹤劑的研究僅有兩項。Wei等［53］采用64Cu-NOTARMT3-23探針和PET，揭示了TIM3陽性免疫細胞在黑色素瘤模型中的分布情況，證實了放射性示蹤劑在追蹤TIM3中的可行性。另一項研究［54］將T I M 3 單克隆抗體與近紅外熒光染料IRDye 800CW偶聯，對GL261膠質瘤細胞C57BL/6小鼠原位移植瘤模型進行體內成像，證實了小鼠TIM3非侵入性成像應用于膠質母細胞瘤的可行性。未來的研究需要開發靶向人TIM3的放射性分子探針，以優化臨床TIM3靶向免疫治療。

6 靶向LAG-3的分子成像

LAG-3是一種在活化的T細胞中上調的免疫檢查點分子，被認為是T細胞衰竭的標志。LAG-3與主要組織相容性復合體Ⅱ結合，從而抑制T細胞的增殖和活化［62］，阻礙抗腫瘤免疫反應。目前，至少有16種LAG-3靶向分子正在臨床試驗中進行評估［63］。新一代雙特異性PD-1/LAG-3阻斷劑也顯示出強大的特異性靶向PD-1或LAG-3高度功能失調的T細胞并增強其增殖和效應活性的能力。

一項研究［56］利用99mTc標記靶向LAG-3的單結構域抗體3132，證實了該探針能特異性地檢測免疫細胞和經改造表達高水平LAG-3的腫瘤細胞上的LAG-3。此后，該課題組［55］通過SPECT/CT評估了99mTc-LAG-3單域抗體對不同腫瘤模型中TIL上LAG-3的成像能力，證明了該探針可以準確定量TIL中的LAG-3水平。Kelly等［57］在免疫缺陷小鼠中證明了89Zr-DFO-REGN3767在表達人LAG-3的M38腫瘤中表現出高特異性攝取。目前兩項臨床試驗正在評估89Zr-DFO-REGN3767，研究生物分布及注射后進行PET掃描的最佳劑量和最佳時間，以監測患者對于抗LAG-3藥物治療的反應。

盡管LAG-3 ICI在腫瘤免疫治療領域中已取得重大進展，但需要進一步的研究來解決LAG-3配體的存在、表達，以及LAG-3/PD-1協同作用的機制等問題［64］。

7 總結及展望

有研究［65］顯示，針對CTLA-4、PD-1/PD-L1免疫檢查點的治療可以提高各種腫瘤患者的存活率，生物標志物的分子成像可以預測其在各腫瘤模型中的治療效果。然而，將動物腫瘤模型的臨床前發現轉化為臨床結果極具挑戰性。一方面，ICI具有的毒性和療效模式，與傳統的化療非常不同；免疫檢查點療法可能會引起一系列免疫相關不良事件，表現為免疫系統活性增加引起的自身免疫樣反應，包括疲勞或發熱等全身性毒性和器官特異性損傷類局部毒性［66-67］。另一方面，目前大多數臨床試驗涉及的腫瘤類型很少，基本局限于非小細胞肺癌、黑色素瘤、腎癌、結直腸癌，此外，研究廣泛的靶點（如CTLA-4、PD-1/PD-L1）的受益人群很小，一些應答者在初始應答后會產生獲得性耐藥，腫瘤的內在因素和微環境的外在因素都可能導致耐藥性［68］。并且缺乏一些創新的靶點，對新靶點的研究還不夠透徹和深入。在臨床研究中靶向免疫檢查點的阻斷藥物的創新相對較少，2019年開發中的活性藥物數量達3 876種，相比2017年和2018年增加了91%，而藥物批準情況卻停滯不前［69］。目前，在臨床研究中靶向PD-1的顯像劑有89Zr-派姆單抗、64Cu-派姆單抗和89Zr-納武單抗。靶向PD-L1的顯像劑有89Zr-阿替利珠單抗、89Zr-阿維魯單抗、18F-BMS-986192。這些藥物在用于腫瘤治療時，可單一使用也可與其他藥物聯合使用。而靶向CTLA-4和LAG-3的藥物目前僅有一種進入了臨床階段研究，伊匹單抗是抗CTLA-4的單抗，通過阻斷CTLA-4與CD80/86配體結合，增強T細胞的激活、增殖和免疫功能，在腫瘤治療方面表現出顯著的療效，但靶向CTLA-4的顯像劑［64Cu-NOTA-伊匹單抗-F（ab’）2、64Cu-NOTA-伊匹單抗、64Cu-DOTA-伊匹單抗］仍處于臨床前研究階段。89Zr-REGN3767是一種針對LAG-3的放射標記抗體，已在淋巴瘤（NCT04566978）和其他晚期惡性腫瘤（NCT03005782）患者中進行首次人體研究［70］。分子探針的特性也是臨床轉化中一個重要的因素。抗體分子探針具有高特異性的特點，但抗體由于相對分子質量較大（約150 000），其組織穿透能力有限。因此較小的蛋白質，如納米抗體越來越受到關注，因為其可以靶向腫瘤細胞上的靶點且可以迅速經血液清除。納米抗體與表位之間的結合也因其結構較小而更緊密，穩定性和靈敏度都很高。大量臨床前研究［71］表明，ICI放射性探針與分子成像技術結合具有在腫瘤診斷和治療時可視化病灶、識別可能受益患者的潛力，這種方法有助于甄別不同患者之間的差異，在個性化醫療中發揮至關重要的作用。

隨著越來越多新靶點的發現，許多ICI探針也完成了臨床轉化，而臨床研究不僅注重ICI的療效，更注重藥物安全。面對這一挑戰，需要準確地評估腫瘤中免疫檢查點的表達情況。傳統的IHC雖能對病變組織中免疫檢查點進行定量分析和分類，但該手段反映的是某時刻的靜態表達，且并非所有患者都可以進行活檢，該方法還存在抽樣誤差和誤判的風險。而ICI放射標記PET能通過非入侵的方式獲得患者全身表達信息，有助于在腫瘤免疫治療中進行動態評估，有利于把握抗體劑量和腫瘤攝取之間的關系，解決同種疾病患者之間治療效果和預后差異的問題。分子探針和分子影像是實現轉化醫學的重要工具，可指導開發新藥物和尋找新的治療方法。本文旨在介紹腫瘤學中免疫檢查點成像的最新進展，闡述分子成像示蹤劑在腫瘤免疫治療中的潛在價值，當前面臨的主要挑戰是如何在疾病治療中實現這些成像方法，未來需要更多的轉化研究和大規模臨床試驗來證明示蹤劑的臨床價值。