兒童侵襲性流感嗜血桿菌的臨床特征及血清型和耐藥性

聶曼杰,孫曹瑋,周娟娟,高凱杰

(鄭州大學附屬兒童醫院/河南省兒童醫院鄭州兒童醫院,檢驗科/鄭州市兒童感染與免疫重點實驗室,河南 鄭州 450000)

侵襲性流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)定義為從無菌體液分離出來的,可侵入血流引起敗血癥、化膿性腦膜炎、肺炎和化膿性骨關節炎等侵襲性感染,患者病情重、進展快、病死率高[1]。非b型Hi血清型和不可分型流感嗜血桿菌(non-typeable Hi,NTHi)在臨床感染中檢出率逐漸升高[2],對抗菌藥物日益耐藥[3],主要耐藥機制是產生β-內酰胺酶以及fts基因突變。本研究分析臨床分離得到的侵襲性Hi的莢膜血清分型、產生β-內酰胺酶表型以及抗菌藥物耐藥特點,深入了解并監測本地區兒童感染侵襲性Hi的動態,為新疫苗的研發提供科學依據,提高臨床對Hi侵襲性感染的重視。

1 資料與方法

1.1 標本來源回顧性研究2016年1月至2022年1月鄭州大學附屬兒童醫院住院患兒無菌部位(血液、腦脊液、胸腹水、骨髓液等)感染Hi的病例,分析其分離菌株;每位患兒取1株分離株,對于多部位感染的患兒,優先選擇來自腦脊液或胸腹水的分離株[4]。

1.2 儀器與試劑Bact/ALERT 3D血培養儀(法國生物梅里埃股份有限公司)、Vitek2-Compact微生物鑒定藥敏分析儀(法國生物梅里埃股份有限公司)、MALDI-TOF Biotyper質譜儀[布魯克(北京)科技有限公司]。莢膜分型血清(丹麥SSI Diagnostica公司)、萬古霉素巧克力瓊脂培養基(廣州迪景微生物科技有限公司)、HTM培養基(廣州迪景微生物科技有限公司)、E-test條(法國生物梅里埃股份有限公司)、藥敏紙片(英國OXID公司)。

1.3 方法

1.3.1臨床資料分析 記錄并分析患兒的體溫、白細胞、降鈣素原(procalcitonin,PCT)、C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)實驗室檢查結果以及抗菌治療效果。

1.3.2細菌培養及鑒定 按《全國臨床檢驗操作規程》第4版[5]要求接種到添加萬古霉素的巧克力培養基,置35 ℃培養18～24 h,根據菌落特點和顯微鏡檢查結果,挑取光滑濕潤、呈灰白半透明或無色透明的菌落,鏡檢為革蘭陰性的小桿菌,用生物質譜儀MALDI-TOF Biotyper進行鑒定。質控菌株Hi ATCC 49247購自國家衛生與健康委員會臨床檢驗中心。

1.3.3藥敏試驗 采用E-test方法檢測Hi對氨芐西林的最小抑菌濃度,應用K-B紙片法檢測其對氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛、阿奇霉素、美羅培南、左氧氟沙星等藥物的敏感性。結果判讀依據2018年美國臨床和實驗室標準化協會文件藥敏標準[6]。用頭孢硝噻吩紙片顯色法試驗定性檢測β-內酰胺酶,用金黃色葡萄球菌ATCC29213作為陽性對照,質控菌株Hi ATCC 49247購自國家衛生與健康委員會臨床檢驗中心。

1.3.4莢膜血清學分型 用Hi多價血清(a、b、c、d、e、f)型和b型血清通過乳膠凝集法對純化后的侵襲性Hi進行血清學分型,產生凝集反應為陽性。同時用9 g·L-1的氯化鈉溶液作為對照,注意是否存在自凝集菌株。

1.4 統計學方法應用WHO細菌耐藥性監測網提供的WHONET 5.6版本軟件進行抗菌藥物敏感性分析,計數資料以頻數(n)和百分比(%)表示,采用χ2檢驗比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料2016—2022年確診侵襲性Hi的例數分別為2、5、8、12、2、2、2例;1—12月例數分別為5、4、0、3、1、4、0、4、3、4、3、2例。33例患兒中血液、腦脊液和骨髓液中同時檢出2例,血液和腦脊液同時檢出9例,血液、腦脊液、腹水和胸腔積液分別檢出17、2、2、1例。33例患兒中5例檢出2種及以上細菌;11例患有基礎疾病(3例頭顱外傷、3例白血病、2例早產兒、1例急性闌尾炎伴穿孔、1例慢性腎病、1例先天性心臟病);最小年齡為1日齡,最大年齡為9歲;1例患兒體溫正常(早產兒血流感染)。2例腹腔感染分別為慢性腎臟病5期在腹膜透析時感染和急性闌尾炎引起感染,1例胸腔積液感染因外傷致急性呼吸衰竭全身免疫力低下所致。32例患兒發熱,31例患兒接受了PCT檢查,16例患兒白細胞異常,22例患兒出現并發癥。具體見表1。

表1 侵襲性Hi感染患兒的一般資料

2.2 藥敏試驗及β-內酰胺酶檢測最初鑒定出46株侵襲性Hi(來自血液28株、腦脊液13株、骨髓液2株、腹水2株、胸腔積液1株),排除了13株重復分離株,排除因死亡或自動出院未做藥敏試驗的4例患兒,共對29株侵襲性Hi進行藥敏試驗分析(表2)。另阿奇霉素和美羅培南敏感率為44.8%(13/29)和96.6%(28/29),在β-內酰胺酶陽性中敏感率分別為26.3%(5/19)和94.7%(18/19),在β-內酰胺酶陰性中則全部非敏感。環丙沙星為喹諾酮類抗生素,考慮到兒童安全用藥,故不推薦臨床首選用藥;三代頭孢(頭孢他啶、頭孢噻肟)和美羅培南敏感率高,可為臨床首選用藥。

表2 29株侵襲性Hi對常見抗菌藥物敏感性

2.3 Hi莢膜分型用莢膜血清對29株侵襲性Hi菌株采用乳膠凝集法進行分型,與b型血清和多價血清均無凝集反應,29株菌株全部為NTHi。

2.4 治療及轉歸針對29例有藥敏結果的患兒,其中16例(55.2%)應用單一抗菌藥物治療(包括三代頭孢12例、亞胺培南2例、美羅培南1例、阿奇霉素1例);10例(34.5%)聯合應用2類抗菌藥物治療(包括碳青霉烯類聯合頭孢菌素4例,頭孢菌素聯合大環內酯類、碳青霉烯類聯合萬古霉素、碳青霉烯類聯合氯霉素類、頭孢菌素聯合萬古霉素、碳青霉烯類聯合青霉素類、頭孢菌素聯合青霉素類各1例);3例(10.3%)在病程中先后使用3種及以上抗菌藥物治療(主要為頭孢菌素、碳青霉烯類、萬古霉素和青霉素類聯合應用)。臨床治療中根據藥敏結果調整用藥,27例(93.1%)患兒治愈或好轉出院,2例(6.9%)死亡或自動出院后死亡,為嚴重外傷或感染的重癥患兒,病程中均使用3種以上抗菌藥物治療。

3 討論

Hi感染主要累及5歲以下尤其是1歲以下患兒[7],本研究中<1歲嬰兒和3～6歲學齡前兒童易感染侵襲性Hi,嬰兒免疫功能發育不完善和學齡前兒童接觸環境復雜等因素為其主要易感原因。研究期間兒童侵襲性Hi發病率在2016—2019年逐漸升高,全年均可發病,無明顯季節性,與其他研究結果[8]基本一致,但在2020年和2021年有明顯下降趨勢,這可能與新型冠狀病毒大流行背景下,各種防疫措施加強有關。本研究中11例有基礎疾病,主要為外傷、免疫力低下及先天性疾病,這些因素都為Hi入侵提供了基礎。臨床實踐中應積極采取措施防治。患兒因白血病化療、血液透析等致免疫力降低,Hi由定植部位入侵無菌部位引起感染,考慮為院內感染,應高度警惕此類機會致病菌的侵襲性感染。

Hi侵入人體,引發炎癥反應,體溫升高,所以發熱為患者的最主要臨床表現,多數患者的CRP、PCT等炎癥標志物水平升高。本研究中患兒高熱及超高熱較多,但白細胞、細菌內毒素等指標無明顯升高,與其他研究[8]不完全相同,這為患兒診治造成干擾。Hi侵襲性感染易引起敗血癥、化膿性腦膜炎等[9],本研究中血流感染及化膿性腦膜炎占比分別為84.8%(28/33)、39.4%(13/33)。

氨芐西林等β-內酰胺酶類藥物既往被認為主要的抗Hi藥物[10],但近年來耐藥率持續升高[11-12],本研究中侵襲性Hi對復方磺胺甲噁唑、氨芐西林耐藥率分別達86.2%、79.3%,侵襲性Hi中65.5%β-內酰胺酶陽性,高于其他研究[8,13]結果及本實驗室之前的研究[14]結果,對侵襲性感染患兒救治提出了較大挑戰。根據最新美國臨床和實驗室標準協會藥敏試驗規范,流感嗜血桿菌對阿奇霉素和美羅培南只有敏感折點,高于敏感折點的無法區分耐藥或中介故只能按照“非敏感”報告及統計。侵襲性Hi對阿奇霉素非敏感率達到55.2%,證實大環內酯類藥物不宜作為治療Hi感染的經驗用藥;對三代頭孢、美羅培南的敏感率高,重癥患兒可經驗性選用。其中1例患兒,前期用美羅培南及萬古霉素抗感染,后根據血培養雙瓶為Hi且對三代頭孢(頭孢他啶、頭孢噻肟)及美羅培南為非敏感,僅對氯霉素及環丙沙星敏感,請臨床藥師會診后考慮感染嚴重。環丙沙星屬于喹諾酮類抗生素,出于安全性考慮,喹諾酮類藥物在兒童中的應用比較謹慎。美國FDA(食品與藥物管理局)批準的、兒童中氟喹諾酮類適應證包括:治療有并發癥的尿路感染和腎盂腎炎,以及預防和治療吸入性炭疽。臨床實際應用中,在充分評估風險和獲益的情況下,針對重癥感染、耐多藥病原菌感染等可酌情使用[15-16]。因此,會診后給予患兒氯霉素聯合超廣譜抗生素美羅培南(碳青霉烯類)抵抗感染,療效良好,血培養Hi為陰性,后因病情嚴重心搏驟停死亡。本研究中大部分患兒應用Hi敏感抗生素(三代頭孢、碳青霉烯類等)治療,但抗生素使用種類較多,多種抗菌藥物聯合用藥不夠合理,如碳青霉烯類或頭孢菌素聯合青霉素類較多,部分患兒藥敏結果明確后未及時調整用藥,雖與侵襲性感染患兒情況危重有關,但仍需進一步提高抗菌藥物合理應用。研究中侵襲性Hi對三代頭孢(頭孢他啶、頭孢噻肟)和美羅培南的耐藥率低、敏感率高,可以考慮作為臨床首選藥物。

有研究顯示107株Hi中67.3% β-內酰胺酶陽性,90.9% NTHi,9.3% β-內酰胺酶陰性對氨芐西林耐藥[17]。四川一項研究表明19株試驗菌都是NTHi[18],由于基因水平轉移,期相變換,噬菌體等作用,NTHi已擁有了侵襲性莢膜型b型Hi的相關毒力因子,且致病力比b型Hi疫苗投入使用前更強[19]。而此次研究的29株侵襲性Hi均為NTHi,40.0% β-內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥,耐藥性強,應該引起重視。β-內酰胺酶陽性菌株對抗生素耐藥性普遍高于β-內酰胺酶陰性菌株,表明侵襲性Hi對抗生素耐藥主要是由于產生β-內酰胺酶而引起。產生β-內酰胺酶菌株對氨芐西林和阿奇霉素耐藥性高于非產酶菌株,但跟李靜等[20]的研究結果有出入,考慮與標本類型以及數量的差異有關。40.0%侵襲性Hi為β-內酰胺酶陰性氨芐西林耐藥菌株,多由細胞壁青霉素結合蛋白3編碼基因ftsI突變導致[21]。少數情況下,有莢膜菌株為適應環境會停止生成莢膜,故單純血清分型會被誤判為NTHi[7],需更嚴謹地進行莢膜基因檢測。

本研究下一步將收集菌株,擴增后進行基因測序,明確耐藥基因的類型及ftsI基因是否有氨基酸置換,結合基因測序結果綜合分析菌株的同源性以及之間的聯系,進一步了解并監測本地區兒童侵襲性Hi的流行病學、耐藥機制、基因突變在耐藥中的影響,為新疫苗的研發提供科學依據。