Lin28B對(duì)三陰性乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制*

曹渤海,胡月明,田莉,王俊然,楊瑞東

(1.唐山中心醫(yī)院 病理科,河北 唐山 063000;2.灤州市人民醫(yī)院 病理科,河北 灤州 063799)

三陰性乳腺癌屬于侵襲性較強(qiáng)的乳腺癌,此類患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率與癌變復(fù)發(fā)率高,是臨床上治療與研究的重點(diǎn)之一[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),Lin28B與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān),在多種惡性程度高的腫瘤組織中呈過表達(dá)狀態(tài)[3],參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過檢測(cè)乳腺癌組織及癌旁組織中Lin28B及Let-7家族的表達(dá)情況,旨在分析Lin28B對(duì)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其潛在機(jī)制,為乳腺癌的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月—2021年1月收治的80例三陰性乳腺癌女性患者為研究對(duì)象,年齡30～65歲、中位年齡(49.21±13.09)歲,絕經(jīng)前37例、絕經(jīng)后43例,有家族史19例,浸潤深度[4]Tis+T1 23例、T2 39例、T3+T4 18例,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移41例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理學(xué)確診為三陰性乳腺癌[5];(2)行手術(shù)治療(其中T3和T4期患者先使用新輔助化療后再行手術(shù)治療)、且術(shù)后經(jīng)病理檢查確認(rèn);(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他惡性腫瘤;(2)術(shù)前接受放療、化療、免疫療法或靶向治療;(3)合并嚴(yán)重糖尿病、甲亢等內(nèi)分泌疾病。患者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1免疫組化(SP法)測(cè)定癌組織、癌旁組織Lin28B蛋白表達(dá) 取三陰性乳腺癌患者癌組織、癌旁組織石蠟標(biāo)本,每份標(biāo)本制成厚度為4 μm連續(xù)切片5張,應(yīng)用SP免疫組化法檢測(cè)Lin28B蛋白的表達(dá);一抗為鼠抗人Lin28B單克隆抗體(濃度1∶50,購自杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司),以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,操作步驟嚴(yán)格按照說明書,由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師參照雙盲法于高倍顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。Lin28B陽性著色定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜,以黃色或棕褐色顆粒為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)[6],每張石蠟組織切片隨機(jī)選取8個(gè)視野,以著色顏色及著色細(xì)胞數(shù)目為依據(jù)進(jìn)行打分:0分為不著色,1分為淺黃色或淺棕色,2分為深黃色或深棕色,3分為棕褐色;陽性細(xì)胞數(shù)為0記0分,陽性細(xì)胞占全視野細(xì)胞數(shù)1%～10%記1分,陽性細(xì)胞占11%～50%記2分,陽性細(xì)胞占51%～80%記3分,陽性細(xì)胞占81%～100%記4分;染色分與陽性細(xì)胞數(shù)分的乘積為總分,總分>3分判定為陽性,否則為陰性。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(RT-PCR)法測(cè)定癌組織、癌旁組織Let-7家族成員miRNA相對(duì)表達(dá)量 采用Trizol法提取癌組織、癌旁組織中總RNA,提取試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,操作步驟按照說明書要求進(jìn)行,采用紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)對(duì)所提取的RNA純度進(jìn)行檢測(cè),合格(A260/A280比值為1.8～2.2)后置于-80 ℃保存待測(cè)。采用RT-PCR 試劑盒(日本Takara公司)對(duì)癌組織、癌旁組織中的Let-7家族成員進(jìn)反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng),以GAPDH 為內(nèi)參,PCR引物由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成。取cDNA 4 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件95 ℃ 2 min、(95 ℃ 30 s,55 ℃ 35s,72 ℃ 60 s)×30個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min。將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳及鑒定,應(yīng)用圖像分析軟件分析目的條帶光密度/內(nèi)參條帶光密度,即目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Lin28B蛋白表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果顯示,Lin28B陽性著色定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜,表現(xiàn)為黃色或棕褐色顆粒,見圖1。乳腺癌組織中Lin28B陽性率高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 Lin28B蛋白在乳腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)[n(%)]Tab.1 Expression of Lin28B protein in breast cancer and paracancerous tissues[n(%)]

2.2 不同浸潤深度及轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中Lin28B蛋白表達(dá)

隨著浸潤深度的增加,乳腺癌組織中Lin28B陽性率依次增加,Tis+T1、T2及T3+T4的Lin28B陽性率分別為52.17%、74.36%、88.89%,3組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽性患者乳腺癌組織中Lin28B蛋白陽性率高于陰性患者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者乳腺癌組織中Lin28B蛋白陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表2。

表2 不同浸潤深度及轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中Lin28B蛋白表達(dá)Tab.2 Expression of Lin28B protein in breast cancer tissues with different invasion depth and metastasis

2.3 Let-7家族成員miRNA表達(dá)

乳腺癌組織中Let-7家族各成員miRNA相對(duì)表達(dá)量均低于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表3。

表3 Let-7家族成員miRNA在乳腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)(n=80)Tab.3 Expression levels of miRNA of Let-7 family members in breast and paracancerous tissues(n=80)

2.4 不同浸潤深度乳腺癌組織中Let-7家族成員miRNA表達(dá)

隨著浸潤深度的增加,乳腺癌組織中Let-7家族成員miRNA相對(duì)表達(dá)量依次降低,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 Let-7家族成員miRNA在乳腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)Tab.4 Expression levels of Let-7 miRNA family members in breast cancer tissues with different invasion depths

注:A擴(kuò)增曲線,B熔解曲線。圖2 RT-PCR檢測(cè)不同浸潤深度乳腺癌組織中Let-7家族成員miRNA表達(dá)曲線 Fig.2 RT-PCR detected-expression curves of Let-7 miRNA family members in breast cancer tissues with different invasion depths

2.5 轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中Let-7家族成員miRNA表達(dá)

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移乳腺癌患者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者癌組織中Let-7家族成員miRNA相對(duì)表達(dá)量分別低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表5、表6。

表5 有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中Let-7家族成員miRNA表達(dá)Tab.5 Expression levels of Let-7 miRNA family members in breast cancer tissues with/without distant metastasis

表6 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者癌組織中Let-7家族成員miRNA表達(dá)Tab.6 Expression levels of Let-7 miRNA family members in breast cancer tissues with/without lymph node metastasis

3 討論

乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌是女性最常見的3種癌癥,其中女性新發(fā)癌癥中的30%為乳腺癌[7-8],是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤[9]。目前對(duì)大部分實(shí)體腫瘤的主要治療方法即是手術(shù)切除,但不能有效地降低術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率。Lin28最早被發(fā)現(xiàn)存在秀麗隱桿線蟲中,其能控制線蟲發(fā)育的時(shí)間和空間,如果一旦產(chǎn)生突變將打亂幼蟲的發(fā)育時(shí)間[10]。研究發(fā)現(xiàn),Lin28在早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化中具有重要作用,是一類伴隨RNA調(diào)控代謝過程的RNA結(jié)合蛋白[11],有研究發(fā)現(xiàn)Lin28B 與腫瘤的惡性程度、耐藥性和不良預(yù)后呈正相關(guān),提示 Lin28B 在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12]。

陳少堅(jiān)等[13]研究發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞中Lin28 mRNA和蛋白呈高表達(dá)狀態(tài),且高表達(dá)的Lin28B可抑制HepG2細(xì)胞對(duì)5-Fu作用的敏感性;李建華等[14]指出,miR-125b可通過靶向調(diào)控致癌基因Lin28B水平影響肝細(xì)胞癌的增殖和侵襲,表明Lin28B的表達(dá)與肝癌的發(fā)生有密切的聯(lián)系。另外,在卵巢癌和食管癌中也發(fā)現(xiàn)Lin28B過表達(dá),說明Lin28B在惡性腫瘤中普遍表達(dá)過高[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Lin28B陽性率高于癌旁組織,表明Lin28B表達(dá)升高可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。Alam等[17]研究發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌中Lin28B的表達(dá)與干細(xì)胞標(biāo)記物HMGA2的表達(dá)成正比,且Lin28B表達(dá)的降低可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)隨著乳腺癌浸潤深度的增加,Lin28B的陽性率也隨之升高,且已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的Lin28B的陽性率明顯增高,表明乳腺癌的轉(zhuǎn)移程度可能與Lin28B的高表達(dá)有關(guān)。上述研究與本文結(jié)論基本一致。

Let-7是長度約20～23個(gè)核苷酸的非編碼RNA(miRNA),與Lin28B一樣,最早被發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲中,可調(diào)控未分化細(xì)胞向分化細(xì)胞轉(zhuǎn)化[18-19]。Let-7家族的靶miRNA主要是癌基因,可誘導(dǎo)靶miRNA剪切或阻礙其翻譯,因而Let-7具有“抑癌基因”的功能。Let-7包括12個(gè)成員,在基因組中分布于8個(gè)以上基因簇中,并通常在癌癥中呈現(xiàn)出低表達(dá)特征[20]。為進(jìn)一步分析由Lin28B所誘發(fā)的癌癥機(jī)制,在本研究中對(duì)Let-7家族成員表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌組織中的Let-7家族成員的miRNA相對(duì)表達(dá)量均低于癌旁組織,且隨著浸潤、轉(zhuǎn)移情況的惡化和Lin28B表達(dá)的升高,Let-7呈現(xiàn)出低表達(dá)特征,表明Let-7的低表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān),推測(cè)Lin28B所誘發(fā)的癌癥機(jī)制如下:Lin28B在Let-7家族的生物起源與mRNA翻譯的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中扮演負(fù)性調(diào)控角色,Lin28B可通過募集末端尿苷,對(duì)Dicer酶加工pre-Let-7的過程起到抑制作用,進(jìn)而引起pre-Let-7降解,還可使pre-Let-7的轉(zhuǎn)錄停留在細(xì)胞核中,導(dǎo)致Dicer酶無法對(duì)其進(jìn)行加工,從而抑制Let-7的成熟,進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增值,導(dǎo)致癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)移,如在乳腺癌、宮頸癌中Lin28B表達(dá)量的升高會(huì)導(dǎo)致Let-7表達(dá)的抑制,形成負(fù)反饋調(diào)控,促進(jìn)癌細(xì)胞遷移侵襲[21-22];此外,Lin28B 和Let-7與某些因子(如RAS、MYC)結(jié)合形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)后可激活大量癌基因及腫瘤信號(hào)分子,導(dǎo)致癌癥的發(fā)生或轉(zhuǎn)移[23-26]。