小麥葉枯病病原菌的形態學與多基因系統學鑒定

鄭童童， 楊雯迪， 王寧， 馬俊杰， 劉龍， 郭慶元

（新疆農業大學農學院，新疆農林外來入侵有害生物監測預警與綜合防控重點實驗室，烏魯木齊 830052）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界三大糧食作物之一[1]。在新疆，小麥栽培面積占糧食作物面積的2/3以上，種植面積達8.57×104hm2，是新疆最主要的糧食作物[2-3]。2019 年6 月，新疆塔城地區額敏縣小麥種植區發現一種罕見病害，癥狀疑似小麥葉枯病，發病植株葉片常具有黃色不規則病斑，病斑周圍有黃色暈圈產生，隨著病情的加重病斑顏色變暗、病斑擴大，嚴重時植株枯萎。由于國內對該類病害的研究報道較少，癥狀上較難準確診斷，且對其病原物種類和病害規律尚未掌握，缺乏有效的防治方法。因此，對該病害的準確診斷是進一步開展針對該病防控研究的基礎。

小麥葉枯病最早于1924 年在印度發現，此后發展成為南亞最主要的小麥病害[1,4]。我國最早在20世紀30年代發現小麥葉枯病，90年代以來在全國發生逐漸嚴重[5-9]。王春江等[10]通過形態學觀察報道了小麥鏈格孢（Alternaria triticina）是引起小麥葉枯病的致病菌。劉鑫燕等[11]通過病斑表型和菌落、孢子形態及真菌ITS1、5.8rDNA 和ITS2區域序列的進化分析鑒定出交鏈鏈格孢（Alternaria alternata）為小麥葉枯病的致病菌。許新江等[12]根據病原菌形態學觀察結合真菌ITS1 和ITS4 區域序列的進化分析將新疆伊犁地區小麥葉枯病病原菌鑒定為細極鏈格孢（Alternaria tenuissima)。

目前，世界上報道的小麥葉枯病病原菌有20 多種，我國鑒定出的小麥葉枯病病原菌有10 多種，造成的病害主要有雪腐葉枯病、鏈格孢葉枯病、殼針孢葉枯病、根腐葉枯病等[10,13-16]。新疆小麥生產區發生的小麥葉枯病大多為雪腐葉枯病和雪霉葉枯病[17]，而鏈格孢葉枯病報道較少，且大多由單一病原菌引起。針對新疆塔城地區新發生的疑似小麥葉枯病，本研究擬通過對該病的實地調查、癥狀對比、病原分離鑒定及柯赫氏證病試驗初步確認其病原菌，并利用形態學與多基因系統學鑒定方法準確鑒定該病病原，準確診斷病害種類，為該病的進一步研究及有效防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

在新疆塔城地區額敏縣小麥生產區隨機選取發病田塊，采集有不規則斑點及病斑（癥狀上疑似小麥葉枯病）的植株，帶回實驗室-20 ℃保存。

1.2 病原菌的分離

采用常規組織分離法對采集的小麥病葉進行病原菌分離。使用滅菌的手術剪將帶有病斑的葉片從小麥植株上剪下，用無菌水洗凈；然后使用滅菌濾紙吸干表面水分，在超凈工作臺中使用1%次氯酸鈉浸泡1 min，75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3～5 次；用滅菌濾紙吸干葉片表面水分。在病健交界處切取輕度變色的葉片組織(約3 mm×3 mm)放 于PDA（potato dextrose agar）培養基上25 ℃恒溫培養；待7 d 左右長出菌落后，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲在PDA 上進行培養，通過單孢分離法獲得各分離物的純培養。將純化的所有菌株挑取菌絲和孢子置于35%甘油凍存管，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 病原菌的致病性測定

采用離體接種和活體接種2 種方法進行致病性測定。

1.3.1 離體接種 在小麥品種新冬22號種植17 d后（3～4葉期）采集葉片；然后將其剪成7～8 cm長，置于事先備好裝有水瓊脂培養基的培養皿（直徑90 mm）中。葉片兩端使用一次性無菌注射器扎5～8 個孔，用直徑6 mm 菌餅接種于刺傷部位，每菌株3 次重復，同時以無菌水瓊脂餅作為空白對照。5 d后移去菌餅觀察發病情況，并比較發病葉片上的病原菌與原接種菌的培養性狀和形態特征是否一致。

1.3.2 活體接種 使用新冬22 號小麥種子，在10 cm×10 cm 育苗盆中培育17 d 后（3～4 葉期），每盆選擇3 株長勢健壯且無其他病菌感染跡象的小麥苗進行針次接種，依然使用一次性無菌注射器進行刺傷，然后接種直徑6 mm 菌餅，保鮮膜纏繞固定，保證菌餅不脫落，同時起到保濕的作用。5 d后觀察接種情況并記錄。

1.4 病原菌的形態學鑒定

選取代表性菌株進行病原鑒定。將菌株接種于PDA 培養基上，25 ℃培養；第3 天開始觀察并拍照記錄，以后每隔2 d記錄1次，觀察菌株變化，至菌落長滿全皿2/3 為止。使用打孔器制作菌餅接種于PCA培養基[10]上，于接種菌餅旁45°斜插滅菌的蓋玻片，5 d后取下蓋玻片在電子顯微鏡下觀察分生孢子、厚垣孢子的形態特征，各測量50 個孢子的大小，將菌株的平板生長狀態以及分生孢子、厚垣孢子形態特征與《中國真菌志》[18]進行對比，初步確定菌株種類。

1.5 病原菌的分子生物學鑒定

1.5.1 病原菌DNA提取 根據病原菌形態學鑒定和致病力驗證結果，將分離所得的致病菌接種于在PDA 培養基，25 ℃恒溫培養7 d 后，用滅菌刀片刮取菌絲置于滅菌的研缽中使用液氮充分研磨，使用新型植物基因組DNA 提取試劑盒（北京天根科技有限公司），參考其操作說明提取真菌DNA。

1.5.2 病原菌rDNA-ITS 和EF-1、Alt基因的PCR擴增和序列測定 對真菌核糖體內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）和EF-1、Alt基因進行擴增，擴增引物如表1 所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 體系均采用25 μL，包括PCRTaqMix 12.5 μL，正、反向引物各1 μL（10 μmol·L-1），模 板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。 PCR 程 序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 10 min。EF-1PCR 程 序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 7 min。Alt PCR程 序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30s，72 ℃1 min，30 個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物用1.0%Agarose 進行凝膠成像觀察及拍照，選擇條帶清晰的擴增產物送上海生物工程有限公司測序。

表 1 擴增片段及其引物Table 1 Primer sequence for PCR amplification

1.5.3 BLAST 比對分析 得到菌株序列后在NCBI 上進行BLAST 比對分析，利用MEGA 7.0 軟件進行多基因拼接，并以鄰接法（neighbor-joining）聚類分析，構建同一個屬不同種的系統發育樹，重復500次。

2 結果與分析

2.1 小麥葉枯病的田間癥狀

小麥葉枯病于苗期開始出現，抽穗期發病嚴重。發病初期在葉片基部出現淡黃色小斑點；后期擴展為橢圓形或梭形，病斑大小不一，病斑中央為黃色或黃褐色，周邊有黃色暈圈（圖1）。

圖1 田間發病Fig. 1 Field incidence

2.2 致病性測定

2.2.1 離體接種 從病株上共得到76 個分離菌株，依次將其編號為 LK1、LK2 …… LK49、LK50和YC1、YC2 ……YC25 、YC26。對76個菌株進行離體接種，結果（圖2）表明，接種3 d 后，接種部位均開始出現明顯的黃化斑點或黃化斑，空白對照無變化；接種5 d 出現褐色壞死斑，癥狀與田間癥狀大致相同。由此表明，分離菌株培養后感染植株的病癥和菌落、孢子形態均與原分離菌株相同，說明76個分離菌株均為致病菌株。

圖2 部分菌株室內離體葉接種癥狀Fig. 2 Some strains showed symptoms of inoculation in vitro

2.2.2 活體接種 對隨機挑取的15 個分離菌株（編號為LK1、LK3、LK5、LK9、LK10、LK19、LK30、LK37、LK40、LK49、YC3、YC10、YC15、YC19）進行活體接種，結果（圖3）表明，接種3 d 后，接種部位均不同程度出現黃化斑，空白對照無變化；5 d 后接種部位出現褐色壞死斑，病斑中央暗褐色邊緣紅褐色，外圍有較大黃色暈圈；將發病葉片剪下處理后進行分離培養后感病癥狀和菌落、孢子形態均與原分離菌株相同。這進一步說明了分離菌株均存在致病性。

圖3 部分菌株室內活株葉接種癥狀Fig. 3 Some strains showed symptoms of leaf inoculation in room

2.3 培養性狀及形態學鑒定

對所有致病菌株進行培養性狀和菌體特征觀察，根據其顯著不同的組間特征與高度相似的組內特征將所有菌株分為3 組：以YC3 菌株為代表的38 個菌株、以LK19 菌株為代表的20 個菌株和以LK3菌株為代表的18個菌株。

2.3.1 YC3等菌株的形態學鑒定 以YC3菌株為代表的38 個菌株最初菌落顏色為淡褐色，隨著培養時間的增加，逐漸變為暗棕褐色；菌餅中央顏色較暗，邊緣顏色逐漸變淺、整齊，蛛網狀白色氣生菌絲發達，分支較多（圖4A 和B）。YC3 為鏈格孢屬的小孢子種。初生分生孢子梗從培養基或氣生菌絲上產生，直或彎曲，分隔，分生孢子單生或2～7 個鏈生，孢子鏈有0～4 個分支；孢子形狀多為倒棍棒型與卵圓形，壁光滑或具細疣，孢子體黃色或深褐色，2～5 個橫隔，0～2 個縱隔，分隔出略益縮；孢子體尺度（15～45） μm×（10～30） μm，初生和次生分生孢子具喙和假喙，（0～15） μm×（2.5～4） μm（圖4C 和D）。根據病原菌培養性狀及形態學特性，將YC3及其具有相同形態特征的38個分離菌株鑒定為交鏈鏈格孢（A. alternata），在本次調查中的分離頻率為50%。

圖4 菌株YC3培養性狀及形態學特征Fig. 4 Strain YC3 characters and morphological characteristics

2.3.2 LK19 等菌株的形態學鑒定 以LK19 菌株為代表的20個菌株最初菌落中心正面顏色為淺綠色，表面密絨狀，菌絲為灰白色，邊緣整齊；背面淺綠棕色，具同心輪紋；隨著培養時間增加，菌絲逐漸由灰白色生長為墨綠色，氣生菌絲稀疏（圖5A和B）。LK19 為鏈格孢屬中的小孢子種。分生孢子梗從培養基表面生出或由氣生菌絲生出，分散，直立或膝狀彎曲，分隔明顯，不分支；分生孢子單生或2～6 個鏈生，孢子鏈有0～5 個分支；孢子形狀為倒梨型、錐形、卵圓形，壁光滑，孢子體暗褐色，2～5個橫隔，0～3個縱隔，分隔出不益縮或略益縮；孢子體尺度（15～40） μm×（10～20） μm；初生和次生分生孢子具錐狀真喙（圖5C和D）。根據病原菌培養性狀及形態學特性，將LK19及其具有相同形態特征的20個分離菌株鑒定為玫瑰鏈格孢（A. rose），在本次調查中的分離頻率為26.3%。

圖5 菌株LK19培養性狀及形態學特征Fig. 5 Strain LK19 characters and morphological characteristics

2.3.3 LK3 等菌株的形態學鑒定 以LK3菌株為代表的18 個菌株最初菌落顏色為灰白色，隨著培養時間增加，逐漸生長為灰青綠色，白色邊緣整齊，氣生菌絲較多（圖6A 和B）。LK3 為鏈格孢屬中的小孢子種。分生孢子梗從培養基或氣生菌絲上產生，直或略彎，分隔，分支或不分支；分生孢子單生或2～6個鏈生，孢子鏈有0～3個分支；孢子形狀多為倒棍棒型，少數為卵圓形、長橢圓形，壁光滑或具微細疣，孢子體暗黃色，2～4個橫隔，0～2個縱隔，分隔出不益縮或略益縮；孢子體尺度（20～50） μm×（5～30） μm；初生和次生分生孢子無喙（圖6C 和D）。根據病原菌培養性狀及形態學特性，將LK3所代表的18 個菌株鑒定為侵染鏈格孢（A.infectoria），在本次調查中的分離頻率為23.7%。

圖6 菌株LK3培養性狀及形態學特征Fig. 6 Strain LK3 characters and morphological characteristics

2.4 病原菌的多基因系統學鑒定

分別對LK3、LK19、YC3 菌株的ITS 和EF-1、Alt基因片段進行PCR 擴增（圖7）和產物序列測定，測序后在NCBI 進行BLAST 比對分析，結果表明，3 個菌株均屬于Alternaria屬。從GenBank 中選 取A. alternata、A. tenuissima、A. rosae、A.infectoria、A. gaisen對應基因序列采用鄰接法（neighbor-joining）構建系統進化樹，結果（圖8）表明，菌株LK3 與侵染鏈格孢（A. infectoria）聚在一個進化分支，同源性為99%；菌株LK19 與玫瑰鏈格孢（A. rosae）聚在一個進化分支，同源性為100%；菌株YC3 與交鏈鏈格孢（A. alternata）聚在一個進化分支，同源性為100%。由此表明，菌株LK3 為侵染鏈格孢（A. infectoria）；菌株LK19 為玫瑰鏈格孢（A. rosae）；菌株YC3 為交鏈鏈格孢（A.alternata）。

圖7 3種引物分別對3個菌株特異性擴增Fig. 7 Three kinds of primers of three strains specific amplification

圖8 基于EF-1、ITS和Alt基因構建的多基因系統發育樹Fig. 8 Polygenic system development tree based on the EF-1， ITS and Alt genes

3 討論

在小麥葉枯病的發生初期，多以形態學觀察來完成病原菌的鑒定。隨著小麥葉枯病在國內發生逐漸加重，鏈格孢屬中多種種間分生孢子形態差異較小，利用形態學精確鑒定區分鏈格孢屬不同種級存在一定困難。為了提高病原菌鑒定的準確性，目前，在植物病原真菌的鑒定中PCR 技術的應用越來越廣泛[22-23]，其中應用最為廣泛的是ITS 片段的序列分析。真菌ITS 序列介于5.8S rDNA、18S rDNA 及28S rDNA 之間，在間隔區上差異性較小，因此，在種間鑒定中ITS 的區分度不是很理想[24-25]。Vu 等[26]在河南省黑胚小麥種子上分離到7 種鏈格孢菌株的ITS 區序列，與NCBI數據庫比對結果顯示，鏈格孢屬在ITS 區高度保守；A. alternata、A. tenissima、A. tenuis的ITS區序列相同（100%）。為此，本研究采用了多基因片段鑒定法，以求得到更準確的種級鑒定。

王春江等[10]分別在小麥病株和小麥種子中鑒定出小麥鏈格孢葉枯病（又稱小麥葉疫病，病原：Alternaria triticinaPrasada and Prabhu）。由小麥鏈格孢（A. triticina）引起的小麥葉疫病是小麥葉枯類病害中潛在威脅性最大的一種檢疫性病害[10]。本研究初期曾以小麥葉疫病為假想目標，但始終未鑒定出小麥葉疫病的病原菌小麥鏈格孢（A.triticina），經一系列的鑒定與驗證明確了新疆塔城地區導致小麥葉枯現象的主要致病菌為交鏈鏈格孢（A. alternata）、侵染鏈格孢（A. infectoria）和玫瑰鏈格孢（A. rosae）；其中交鏈鏈格孢的分離頻率最高，是最主要的致病菌。

劉鑫燕等[11]鑒定出小麥交鏈鏈格孢（A.alternata）為小麥葉枯病的致病菌，在研究中交鏈鏈格孢也是主要致病菌。由此表明，交鏈鏈格孢是小麥葉枯病較為常見的病原菌種。葉娜[1]認為小麥葉枯病癥狀類型主要有2種，分別由鏈格孢葉枯菌和根腐離蠕孢葉枯菌侵染所致，2種病原菌常相互混合發生侵染。本研究也表明小麥葉枯病癥狀存在Alternata屬內致病種混合侵染的情況。

到目前為止，在國內尚未見到玫瑰鏈格孢（A. rosae）造成小麥葉枯病的報道。本研究首次鑒定出玫瑰鏈格孢可侵染小麥導致葉枯病癥。這說明玫瑰鏈格孢對小麥生產存在危害，今后應針對該菌種對小麥的危害情況及其對其他作物的潛在風險進行評估，并對小麥葉枯病害的控制方法開展進一步研究。