洋蟲內產β-葡萄糖苷酶內生菌發酵液轉化人參皂苷產物分析及其抗腫瘤活性研究

胡茜， 王藝凝， 申鵬飛， 李雅倩， 楊陽， 王艷成，姬文秀*， 董微巍*

（1.延邊大學農學院， 吉林 延吉 133000； 2.吉林省和龍市工商聯， 吉林 和龍 133400）

人參（Panax ginsengC. A. mey）為五加科人參屬多年生草本植物[1]。在2012 年，人參（人工種植）被國家衛生部批準為新資源食品，同時其在保持人體健康和平衡機體狀態方面的保健作用日漸引起人們的關注[2-3]。人參皂苷是人參中主要的活性成分，具有抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂、促進細胞再生等多種功效[4-9]。研究表明，人參皂苷口服后在人體腸道菌作用下轉化為人參皂苷的去糖基代謝產物更具藥理活性[10]，如Rh1、Rg3 和compound K 等都可以直接作用于癌癥組織，具有較強的抗腫瘤活性[11-14]。但是，由于人體腸道菌群的個體差異及人參皂苷在體內的停留時間等原因，使有些皂苷未在轉化前就被排出體外，因此口服人參皂苷的作用效果較低，在生物體內的利用率不高。因此，體外人參皂苷去糖基化修飾對于提高人參的藥用價值具有十分重要的意義。

內生菌資源在天然產物的生物轉化中作為一類新型生物催化劑備受關注[15-16]。藥用昆蟲洋蟲內生菌資源豐富，體內生存環境獨特[17]，因其喜食中藥人參所以推測其體內具有產β-葡萄糖苷酶水解人參皂苷功能的內生菌。因此，本研究對洋蟲體內高效產β-葡萄糖苷酶內生菌進行篩選、鑒定，制備復合工程菌劑，液態發酵轉化人參皂苷，提高Rh1、Rg3、compound K 等去糖基化人參皂苷的轉化率，對動態發酵反應過程中人參皂苷及其代謝產物化學組成進行研究，采用體外模擬人參皂苷在洋蟲體內的代謝過程，明確其生物轉化機制，利用四甲基噻唑藍（methylthiazoletrazolium，MTT）染色法闡明低、中、高劑量發酵產物對肺癌A549細胞抗腫瘤活性，為人參皂苷系列產品及功能產品的開發奠定基礎，為中藥資源的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗材料：人肺腺癌耐順鉑株（A549/DDP）購自武漢普諾賽生命科技有限公司（Procell Life Science & Technology Co., Ltd.）；洋蟲來自延邊大學植物保護實驗室；正丁醇、無水乙醇、次氯酸鈉等均為分析純，購于南京化學試劑股份有限公司；新鮮人參根（4 年生植物）來自于吉林集安人參培育基地；人參皂苷標準品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh1、Rg2、Rg3、F1、PPD 和compound K 購于國家標準物質網。

儀器包括離心機（TD-4C 型，金壇區金城海瀾儀器制造廠）、旋轉蒸發儀（RE-2010 型，鄭州予達儀器科技有限公司）、培養箱（德國Heraus 公司）、倒置熒光相差顯微鏡（CR15-860HD 型，蘇州倍特嘉光電科技有限公司）。

1.2 人參皂苷提取物的制備及定性分析

人參粗皂苷制備：取100 g 洗凈的人參，干燥后粉碎成粉末，利用80%乙醇在82 ℃條件下索氏回流提取3 h，反復提取2 次后將萃取液合并，真空旋干，再置于烘箱50 ℃干燥脫水，制備人參粗皂苷粉末，備用。

定性分析：使用甲醇溶解人參皂苷粉末后用0.22 μm 濾膜過濾，利用液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析人參粗皂苷中的單體皂苷組成。

1.3 洋蟲內生菌液的制備

以紅棗和人參飼料按4∶1 的混合比例對洋蟲進行飼養，培養箱體積40 cm×60 cm×20 cm，培養箱恒溫24 ℃、濕度75%的飼養條件下飼養1 年。取洋蟲成蟲、幼蟲各45 只，同齡期洋蟲15 只為1 組，每組生物學重復3 次；將洋蟲用無菌水清洗干凈后，在厭氧培養箱內將其頭部、翅部去除，放置于75%乙醇中90 s，后經次氯酸鈉溶液浸泡15 s，去除洋蟲體表微生物后用滅過菌的蒸餾反復沖洗，研缽研磨，加入蒸餾水移至離心管；500 r·min-1離心5 min，將上清液取出，再10 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀；最后向沉淀中加入PBS 緩沖液，制備成洋蟲內共生菌液。

1.4 產β-葡萄糖苷酶功能菌株篩選、鑒定及高產β-葡萄糖苷酶復合菌發酵液的制備

1.4.1 七葉苷培養基篩選高效產β-葡萄糖苷酶功能菌株 取100 μL 稀釋好的洋蟲菌液加到MRS 篩選培養基（添加秦皮甲素和檸檬酸鐵），將洋蟲菌液均勻地涂布在培養基上，于恒溫培養箱中顛倒放置，在厭氧條件下培養72 h，觀察菌落生長。將邊緣整齊且呈黑褐色的單一菌落挑選出來，將其接種到新的純化培養基上，進行多次重復純化直至得到單一菌株。從菌株中挑選出4 株菌落顏色較深且生長狀態良好的菌株，即為高效功能菌株。

1.4.2 產β-葡萄糖苷酶功能菌株的分子生物學鑒定 采用土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336）提取基因組DNA，采用通用引物（上游引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和下游引物ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR。PCR體系25 μL，包括：1×PCR buffer、1.5 mmol·L-1MgCl2、200 μmol·L-1dNTPs 0.5 μmol·L-1上下游引物、50 ng模板DNA 以及0.5 UTaqDNA 聚合酶。以ICycler 熱循環儀進行擴增，PCR 程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，32 個循環；72 ℃7 min。PCR 產物檢測合格后送北京百邁客生物科技有限公司進行測序。

1.4.3 高產β-葡萄糖苷酶復合菌液的制備 按照相同比將4 株功能菌株進行5 d 的規模化培養馴化，制備成復合工程菌種子液，備用。

1.5 復合菌液與人參皂苷的發酵反應

取人參皂苷粗提物4 mg，加入種子液500 μL至2 mL 離心管中，混合均勻，在厭氧條件下（N285%，H210%，CO25%）將篩選出的菌株及篩選菌株的混合菌株富集培養24 h 后，將菌液與人參主皂苷反應20 d，分別在生物反應時間為0、1、2、3、7、12 和20 d 時采集發酵產物，利用LC-MS/MS 測定分析。

1.6 HPLC-MS/MS發酵產物分析

1.6.1 色譜條件 采用安捷倫1260 系列液相色譜系統與安捷倫Poroshell ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和C18保護柱進行檢測分析。該系統使用Mass Hunter 采集軟件B.07.00 進行操作。流動相A 為0.1%甲酸-水溶液、B 為0.1%甲酸-乙腈溶液。采用梯度洗脫程序：B體積分數由0%于0—20 min 內線性升至23%；在13—33 min 由23%提升至46%；在33—38 min 由46%提升至68%；在38—45 min以68% 維持7 min；在45—55 min 由68% 提 升 至100%；在55—63 min 由100%降至23%。進樣量2 μL，流速0.5 mL·min-1，檢測波長203 nm。

1.6.2 質譜條件 采用安捷倫1260HPLC 系統聯用安捷倫6420 三重四級桿串聯質譜(ESI-QQQMSMS, Agilent Technologies, Santa Clara, USA)進行質譜分析。離子化條件如下：ESI 電離源，正離子掃描，噴霧電壓4 kV。采用二級全掃描模式，掃描質荷比范圍500～1 500。采用多離子檢測模式作為篩選及評價方法，對各天然物樣品中皂苷類物質進行初步篩選檢測，數據處理軟件為Mass Hunter工作站B.06.06軟件[18]。

1.7 發酵產物對A549細胞抗腫瘤活性

取處于對數生長期的A549細胞，將細胞懸液的含量調至5×104cell·mL-1。96 孔培養板中每個孔加入100 μL 細胞懸液，將其放入5% CO2、37 ℃培養箱培養24 h，至細胞長至單層；然后將孔中上部澄清的液體吸出舍棄，利用PBS 緩沖液洗1～2遍后，加入培養基（不含血清）稀釋分別得到0、0.5、2.0、5.0 mg·L-1的篩選組分。每個水平6 次重復。每個孔抽取100 μL 篩選出來的組分。將細胞板放在培養箱中孵育48 h，繼續將孔中上部澄清的液體吸出舍棄，用PBS 溶液淋洗2 遍。在MTT法中，向每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·L-1，即0.5% MTT）和80 μL 培養基（不含血清），4 h后培養終止，小心吸去孔內培養液。每孔加入150 μL DMSO，搖床低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。利用ELISA reader 在波長490 nm 測得OD值，同時觀察細胞活性。試驗中設立空白對照（無細胞，加培養基、MTT 和DMSO）。3 次重復試驗，取平均值用來計算細胞抑制率。

1.8 方法評價

進樣液體為10 種人參皂苷標準品的混合溶液。以混合標準系列溶液的濃度為橫坐標，以定量離子色譜的峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線。稀釋混合標準溶液，用信噪比S∶N =3∶1 時的含量計算各人參皂苷標準品的最低檢出含量（limit of detection，LOD），用信噪比S∶N =10∶1 時的含量計算定量限（limit of quantitation，LOQ）。向空白菌液發酵產物樣品中分別添加高（5 mg·L-1）、中（2 mg·L-1）、低（0.5 mg·L-1）3種不同水平的混合標準溶液，每個水平平行制備3份，進行加標回收率試驗。

1.9 數據分析

采用SPSS11. 5軟件進行數據的統計分析。

2 結果

2.1 人參皂苷樣品的統計與評價

配制100、200、500、1 000、2 000、5 000、8 000和10 000 ng·mL-1人參皂苷標準液，以人參皂苷標準品質量濃度為x軸，其對應峰面積為y軸繪制標準曲線。結果（表1）表明，在100～10 000 ng·mL-1范圍內，10 種皂苷標準品的線性關系較好，R2均在0.99以上。以3倍信噪比計算10種標準品的檢測限，不同標準品的檢測限在8.5～12.9 ng·mL-1之間；以10 倍信噪比定量限，不同標準品的定量限在28.8～34.9 ng·mL-1之間，平均回收率為83.9%～119.3%，表明該方法可以滿足檢測要求。

表1 人參皂苷樣品的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢測限、定量限及回收率Table 1 Regression equation， correlation coefficient， linear range， detection limit， quantification limit and recovery rate of ginsenoside samples

2.2 產β-葡萄糖苷酶功能菌株的分子生物學鑒定

通過篩選培養基培養，從洋蟲成蟲、幼蟲菌液中篩選出4株具有明顯顯色反應的產β-葡萄糖苷酶功能菌株，經18S rRNA 基因擴增進行分子生物學鑒定和Blast 數據庫比對，4 個菌株分別為煙曲霉（Aspergillus fumigatus） 、鴿 色 藍 狀 菌（Talaromyces columbinus）、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）及粉色面包霉菌（Neurospora crassa）（表2）。

表2 4株菌的18S rRNA基因相似性對比及鑒定結果Table 2 Comparison of 18S rRNA gene similarity of 4 strains and identification results

2.3 洋蟲內生菌復合菌液發酵人參皂苷粗提物發酵產物分析

2.3.1 復合菌液與人參皂苷發酵產物定性分析由圖1和圖2可知，在人參皂苷提取物中共檢測出Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2 和Rd 7 種人參皂苷；在復合菌液中功能菌的協同作用下，轉化產物中檢測出Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2 和Rd 7 種人參皂苷和Rg3、compound K和Rh1 3種人參皂苷去糖基化產物，且隨著時間的延長其代謝產物含量呈明顯升高趨勢。由此表明，利用洋蟲內生菌復合菌液直接發酵人參皂苷粗提物可同時制備多種高活性次級人參皂苷產物。

圖1 4株產β-葡萄糖苷酶真菌聯合發酵人參皂苷提取液產物分析Fig. 1 Analysis of the product of 5 strains of β-glucosidase-producing fungi combined fermentation of ginsenoside extract

圖2 發酵產物EIC色譜圖Fig. 2 EIC chromatogram of fermentation products of ginseng extract

2.3.2 復合菌液與人參皂苷發酵產物定量分析由圖3 可知，大部分人參皂苷隨著發酵反應的進行含量逐漸減少；而人參皂苷Rd的含量為先降低后升高；發酵產物人參皂苷Rg3 的含量先增加后降低，8 d 時含量最高，為425 mg·mL-1，20 d 時降至221 mg·mL-1；去 糖 基 化 人 參 皂 苷Rh1 和compound K 含量呈上升趨勢。這可能是隨著發酵反應進行人參皂苷被水解，大部分人參皂苷含量降低，其中人參皂苷Rd作為代謝中間產物在代謝初期被水解轉化，同時二醇類皂苷Rb1、Rc、Rb2在發酵反應過程中C-20位外部糖基被水解掉又轉化生成Rd，因此，0～3 d 人參皂苷Rd 含量呈下降趨勢，在3～20 d又呈升高趨勢。Rd在β-葡萄糖苷酶等水解酶的作用下（水解掉C-20 位糖基）轉化為分子量更小的人參皂苷Rg3，同時C-3位糖基被復合功能菌水解產生人參皂苷compound K，因此，Rg3 和compound K 含量隨發酵時間的延長逐漸增加。三醇類人參皂苷Rg1、Re、Rf的主要發酵產物為稀有人參皂苷Rh1，其中，Re 在β-葡萄糖苷酶等水解酶的作用下C-6 位外部糖基被水解掉，轉化生成人參皂苷Rg1，Rg1 再水解掉C-6 位外部糖基轉化生成人參皂苷Rh1；Rf 直接被水解掉C-6 位外部糖基轉化生成Rh1，因此，Rh1 含量呈上升趨勢。綜上所述，人參皂苷二醇類皂苷以Rd為中間代謝產物，生物轉化途徑為Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K；三醇類人參皂苷的轉化途徑為Re→Rg1→Rh1和Rf→Rh1，且人參皂苷二醇類皂苷更容易被發酵菌劑水解。

圖3 4株產β-葡萄糖苷酶真菌聯合發酵產物人參皂苷定量分析Fig. 3 Quantitative analysis of ginsenosides from the combined fermentation of 4 β-glucosidase-producing

2.4 復合菌液與人參皂苷發酵產物對肺癌A549細胞活性的影響

由圖4 可知，復合菌液與人參皂苷發酵產物具有較好的抗腫瘤活性，抗腫瘤效果優于發酵菌液及人參皂苷粗提物。對比復合菌液與人參皂苷發酵20 d 產物在不同劑量（0.5、2.0 和5.0 mg·L-1）和不同處理時間下對肺癌A549細胞抑制效果，結果（圖5）表明，發酵產物在5.0 mg·L-1、反應72 h時對腫瘤細胞的抑制率達85%，且在一定的范圍內隨著發酵產物質量濃度的升高對腫瘤細胞的抑制率明顯升高。

圖4 洋蟲內生真菌/人參皂苷20 d發酵產物對肺癌細胞A549的細胞抑制率Fig. 4 Inhibition rate of 20-day fermentation product of endophytic fungi/ginsenosides of worms on lung cancer cell A549 fermentation

圖5 復合菌液-人參皂苷發酵產物對肺癌A549細胞的活性抑制率Fig. 5 Inhibition rate of compound bacterial liquid-ginsenoside fermentation product on lung cancer A549 cells

3 討論

稀有人參皂苷的各種生物活性越來越受到人們的重視，但是由于其天然含量低，使其在開發利用時備受限制，利用生物轉化法對人參皂苷的糖鏈進行結構修飾，成為獲得稀有人參皂苷的有效途徑。目前，多數研究停留于單一菌株轉化單一皂苷，如程雅韻等[19]從發酵食品中分離篩選出1株產β-葡萄糖苷酶的植物乳桿菌菌株E9，可將Rb1轉化成Rg3；張麗娜等[20]從人參種植土中篩選到1 株可將Re 轉化為Rhl 的菌株S329，但是皂苷單體提純工藝復雜，產品生產成本價格高，因此難以推廣應用于生產實踐。本研究利用喜食人參的洋蟲源內生菌復合劑直接發酵人參皂苷粗提物，同時制備多種高活性次級人參皂苷產物，使其更具有實際應用價值。

不同人參皂苷單體具備不同的藥理活性。目前，人參皂苷發酵產物在抗腫瘤方面取得突破性進展，庫受權[21]檢測紅曲霉和人參雙向固體發酵產物對宮頸癌Hela 細胞的抑制率，當發酵產物質量濃度為200、100、50 和25 μg·mL-1時抑制率分別為50.89%、36.19%、23.18%、20.68%，與本研究結果一致，即在一定范圍內，發酵產物對癌癥細胞的抑制率隨著其質量濃度的增加逐漸升高。吳彤[22]用MTT 比色法與流式細胞儀分析Rg3對人大腸癌細胞株HCE8693 的生長抑制作用，發現當Rg3 含量為0.010%、0.017%、0.025%和0.050%時對HCE8693 細胞的生長抑制率分別為8.6%、8.6%、18.7%和21.9%。對比前人研究結果，本研究的復合菌劑與人參皂苷發酵代謝產物更加豐富（10 種），乙醇萃取的發酵產物在5.0 mg·L-1、反應72 h 時的腫瘤細胞抑制率可達85%，且隨著發酵產物質量濃度的增加，對腫瘤細胞的生長抑制率明顯升高，即對腫瘤細胞生長的抑制效果更加明顯。此后，在此基礎上本課題組將進一步深入研究，探明復合菌劑與人參皂苷發酵產物抑制腫瘤細胞生長的作用機制，為抗腫瘤先導藥物研發奠定理論基礎。