活性口袋關鍵色氨酸對幾丁質酶Chi304催化性質的研究

田曉倩， 盧海強， 伍寧豐， 田健， 關菲菲*

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000； 2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

幾丁質又稱甲殼素、甲殼質，由直鏈N-乙酰氨基葡糖胺通過β-1,4糖苷鍵連接而成，是一種古老而豐富的結構氨基多糖[1]。幾丁質最早在真菌（1811 年）和節肢動物（1826 年）中發現，之后在各物種中均有發現，包括原生動物、硅藻、珊瑚藻、海綿、珊瑚、蠕蟲、苔蘚、軟體動物、昆蟲、蜘蛛以及甲殼類動物等[2]。幾丁質的降解產物為幾丁寡糖（N-acetyl chito oligosaccharide, NACOS），可作為抗菌物質、生物活性劑，廣泛應用于食品、生物醫藥、農業等領域[3-6]。幾丁寡糖（DP＞2）在抗癌、抗腫瘤、免疫活性等方面有顯著優勢，如(GlcNAc)6對移植到小鼠體內的Lewis 肺癌（Lewis lung cancer，LLC）細胞有著顯著的抗轉移作用，且能夠抑制局部腫瘤生長[7]。高分子量幾丁寡糖（1～3 kD）比低分子量幾丁寡糖（＜1 kD）對細胞中蛋白質氧化和自由基產生的抑制效果更好，此外，幾丁寡糖還可作為潛在的氧化應激清除劑[8]。

幾丁質酶（EC 3.2.1.14）屬于糖苷水解酶（glycoside hydrolases, GH），可水解幾丁質中的β-1,4 糖苷鍵。根據碳水化合物活性酶數據庫（http://www.cazy.org/, CAZy），幾丁質酶主要屬于GH18 和GH19 家族，部分幾丁質酶也被劃分到其他GH 家族，例如GH23 和GH48 家族[9]。GH18 家族的幾丁質酶來源廣泛，如真菌、細菌、昆蟲、線蟲以及一些哺乳動物等[10]。GH18家族幾丁質酶的結構特點為(β/α)8桶狀結構，即8條平行的β-折疊鏈形成1 個桶狀，α-螺旋依次向外形成1 個環[11]。在這個(β/α)8桶狀結構中，β4由1 個保守的序列基序（DXDXE，D為天冬氨酸、E為谷氨酸、X為任意氨基酸）形成酶的活性中心位點[12]。GH18 細菌幾丁質酶又分為3 個亞家族，分別為A、B 和C[13]。其中A亞家族GH18家族幾丁質酶擁有一個深溝，該類酶通常為外切型水解酶，特點是持續性水解底物，芳香族氨基酸在水解幾丁質過程中發揮著重要作用[14-15]；B 亞家族GH18 家族內切幾丁質酶數量較少，擁有較淺的裂縫，與底物結合，B亞家族幾丁質酶較A亞家族含有更少的芳香族氨基酸殘基[16-17]。

近年來，越來越多的幾丁質酶基因被克隆表達，但普遍存在酶活力弱、熱穩定性差等問題，且內切幾丁質酶的研究尚淺[18]。GH18 家族的幾丁質酶多數發揮外切型水解酶活性，主要產物為N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺或二乙酰殼二糖，如從玉米螟中克隆的幾丁質酶OfCht5 將幾丁質有效降解為(GlcNAc)2與少量GlcNAc，與β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶OfHex1 同時作用可將幾丁質完全轉化為GlcNAc[19]。典型B 亞家族內切幾丁質酶SmChiC 是非持續性內切型水解酶，但其熱穩定性差，且水解幾丁質的主要產物仍是二乙酰殼二糖[20]。

本研究前期從海洋宏基因組文庫中篩選到1個嗜熱幾丁質酶Chi304，在85 ℃顯示出最高酶活力為12.28 U·mL-1，該酶水解膠體幾丁質的主要產物為二乙酰殼二糖（DP2），同時產生少量三乙酰殼三糖（DP3）以及微量N-乙酰氨基葡萄糖胺[21]。該酶熱穩定性好，因此，本研究采用理性設計的方法分析得到2 個色氨酸，將其定點突變對酶進行改造，以產物成分DP3/DP2來評估突變體的效果。期望通過對現有性能優良的幾丁質酶改造，使其能夠水解幾丁質以快速高效的生產幾丁寡糖（DP＞2）。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 質粒pET30a(+)-chi304與及表達菌株BL21(DE3) 為本實驗室保存。

1.1.2 試劑 鎳柱填料購自GE 公司，BCA（bicinchoninic acid）蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，幾丁質購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺（N-Acetyl-D-Glucosamine，GlcNAc）與六乙酰殼六糖〔(GlcNAc)6〕標準品均購自Megazyme 公司，本試驗所用其他試劑為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基與溶液 LB培養基：蛋白胨10 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1、酵母膏5 g·L-1，固體含瓊脂粉15 g·L-1；2% 膠體幾丁質制備參照文獻[22]中的方法略做改進，2 g 幾丁質粉末溶于18 mL 濃鹽酸后，加入182 mL 預冷的95%乙醇混勻，用蒸餾水洗混合物直至中性后定容為100 mL；DNS（3,5-dinitrosalicylic acid）顯色劑：3.15 g·L-13,5-二硝基水楊酸、0.5 mol·L-1氫氧化鈉、90 g·L-1四水合酒石酸鉀鈉、2.5 g·L-1苯酚、2.5 g·L-1無水亞硫酸鈉。

1.2 方法

1.2.1 同 源 建 模 利 用Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/）同源序列建模，用野生型Chi304 氨基酸序列進行模板檢索，并將全局模型質量評估值（global model quality estimate，GMQE)按照從大到小排列。

1.2.2 單點突變體的構建 按照大腸桿菌密碼子偏好性用Oligo 7 設計突變體引物W140A-R: 5'-CCGCTACGGCTCGCGCCACCAAC-3'與W272AR: 5'-GTAACGTTCTCCGCGCCACCGTG-3'（下劃線為突變位點堿基序列），PCR進行定點突變，構建的質粒轉入大腸桿菌TOP10感受態細胞，陽性克隆子的測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 蛋白表達與濃度定量 測序正確的質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑選陽性克隆子培養種子液，種子液以1%接種量加入到卡那霉素抗性培養基中，37 ℃培養至細菌對數生長期（OD600=0.6～0.8），添加異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG）使其終濃度為0.1 mmol·L-1，于16 ℃、200 r·min-1繼續培養18～20 h。離心（8 000×g, 5 min）收集菌體，按相應菌液體積的1/10加入20 mmol·L-1Tris-HCl重懸菌體，超聲波破碎儀進行細胞破碎，離心（13 786×g 30 min）后上清液用鎳柱進行蛋白純化，純化后蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳。BCA蛋白定量按試劑盒說明書中微孔檢測法進行測定。

1.2.4 酶活力測定 采用3、5 二硝基水楊酸（DNS）法[23]測定幾丁質酶活力，以N-乙酰-D-氨基葡萄糖胺標準品繪制標準曲線。Chi304 及突變體在85 ℃、pH 9.0 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中水浴反應30 min，各成分終濃度膠體幾丁質含量5‰，酶濃度0.025 mg·mL-1，緩沖液0.1 mol·L-1，反應結束后加入1 mL 的DNS 溶液煮沸顯色10 min，取上清液200 μL于酶標儀96孔板中測定OD540。

幾丁質酶活力單位（U）：以膠體幾丁質為底物，在最適條件下，每分鐘內轉化生成1 μmol 還原糖（以生成GlcNAc的量計算）所需的酶量，稱為一個酶活力單位（1 U）。

1.2.5 酶水解產物分析 Chi304 及突變體在相同酶活力單位（0.25 U）下水解5 mg·mL-1膠體幾丁質，0.05 U 水解1 mg·mL-1(GlcNAc)6，每組設置3 個平行，水解條件：85 ℃，pH 9.0 水解30 min，然后加入1 mL 氯仿終止反應，12 000 r·min-1離心1 min后取上清液，0.22 μm水相濾膜過濾后，用高效液相色譜分析產物成分。色譜柱：shodex suger KS-802；檢測器：Shimadu RID-20A；分離相：HPLC水；流速：0.6 mL·min-1；檢測時間：30 min；柱溫：65 ℃；進樣體積：20 μL。

1.2.6 酶水解六乙酰殼六糖時程分析 0.002 U的 酶 水 解1 mg·mL-1的(GlcNAc)6，水 解 條 件：85 ℃，pH 9.0，水解時間分別為0、2、5、10、30、60、120 min，每組設置3 個平行。反應結束后加入1 mL 氯仿終止反應，12 000 r·min-1離心1 min 后取上清液，0.22 μm 水相濾膜過濾后，用高效液相色譜分析產物。

2 結果與分析

2.1 幾丁質酶Chi304結構分析

利用Swiss-Model 同源建模方法構建Chi304蛋白質的結構，結果顯示，GMQE 最大值為0.5，對應蛋白為5zl9.1.A，以此為模板對Chi304 進行同源建模，得到Chi304 的三維結構信息，如圖1A 所示。Chi304 屬于GH18 家族，含有644 個氨基酸，活 性 位 點Y49、F79、D176、D178、E180、M264、Y266、D267、Y323、W420 均位于中間桶8 個β-折疊的末端上。高度保守176DIDWE180催化活性中心水解底物，催化水解機制是經典的反轉機制，酸堿催化需要2 個酸性谷氨酸殘基，一個作為酸（質子供體），另一個作為堿（親核試劑），天冬氨酸為輔助殘基[24]。在Chi304 底物結合口袋附近存在2 個暴露于表面的芳香族氨基酸W140 與W272，這2 個位點均在連接β-折疊的loop 上（圖1B）。這2 個色氨酸的側鏈苯環結構可能與酶和底物的結合有關[25]。后續研究將這2 個色氨酸突變為無側鏈的丙氨酸，以打開酶與底物的結合通道。

圖1 Chi304結構信息Fig. 1 Structure of Chi304

2.2 Chi304及突變體的表達

將成功構建的質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞并進行誘導表達，表達后的蛋白用鎳柱進行純化并使用SDS-PAGE檢測蛋白表達情況，結果如圖2所示。Chi304和突變體W140A、W272A的蛋白均表達較好，目標條帶單一，且與理論大小一致，約71 kD。DNS法檢測酶活結果表明，突變體與野生酶均有活力，但突變體W140A與W272A的酶活力較野生型分別下降44.7%與43.0%。

圖2 Chi304突變體SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of Chi304 mutants

2.3 Chi304及突變體水解產物

為了解析突變體活力降低是否與內、外切活力改變相關，將Chi304 與突變體稀釋成相同的酶活力，檢測其水解膠體幾丁質和六乙酰殼六糖生成幾丁寡糖的能力。將野生型Chi304 和突變體W140A、W272A稀釋為相同酶活力單位0.25 U，于85 ℃、pH 9.0緩沖液中同時水解膠體幾丁質（終含量50 mg·mL-1）30 min，水解產物成分為GlcNAc、(GlcNAc)2和(GlcNAc)3。分析產物成分DP3與DP2的比例，W140A與W272A分別較野生型提高23.3%與45.7%（圖3）。進一步解析水解可溶性寡糖(GlcNAc)6，結果顯示生成(GlcNAc)3的量較野生型分別提高3.2 與2.7 倍；生成(GlcNAc)2的量較野生型分別降低25.2%與33.8%。因此，突變體W140A與W272A呈現出與野生型不同的機制，突變體內切底物長鏈幾丁質獲得(GlcNAc)3的活力明顯提升，外切獲得(GlcNAc)2的活力明顯下降（圖3）。綜上所述，這2個位點可能是影響Chi304外切活力與內切活力的關鍵位點。

圖3 Chi304及突變體的水解產物Fig. 3 Hydrolysate of Chi304 and mutants

2.4 雙點突變體W140A/W272A 的構建與功能鑒定

為了進一步研究這2 個位點的作用，設計了雙點突變體W140A/W272A。經誘導表達經鎳柱純化后，用SDS-PAGE 蛋白電泳檢測蛋白質量，突變體W140A/W272A成功表達，且蛋白分子量與理論計算大小一致，約71 kD，目標條帶單一（圖4）。DNS 法檢測酶活力表明，突變體W140A/W272A的酶活力仍能保留野生型的40%。分別取相同酶活力單位0.25 U，將野生型及雙點突變體均于85 ℃、pH 9.0條件下水解底物膠體幾丁質，水解產物用HPLC 分析，雙點突變體W140A/W272A的產物成分DP3/DP2較野生型提高80%，說明雙點突變體的內切長鏈幾丁質獲得(GlcNAc)3的活力明顯提升，外切獲得(GlcNAc)2的活力下降。

圖4 W140A/W272A的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of W140A/W272A

2.5 突變體W140A/W272A水解（GlcNAc）6解析

為了進一步探究突變體積累(GlcNAc)3的機制，分別在0、2、5、10、30、60和120 min下用0.002 U的Chi304與W140A/W272A于85 ℃、pH 9.0條件下分別水解可溶性幾丁寡糖(GlcNAc)6。結果顯示，Chi304 與W140A/W272A呈現出不同的水解模式。野生Chi304 水解(GlcNAc)6的最終產物只有GlcNAc、(GlcNAc)2與(GlcNAc)3，底物充足時迅速 水 解(GlcNAc)6生 成(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和(GlcNAc)4；(GlcNAc)6被 消 耗 完 后，(GlcNAc)4繼續被水解直至消耗完全；隨著時間延長，(GlcNAc)3也會被繼續水解（圖5A）。以上結果說明野生型Chi304 主要發揮外切活性。與Chi304 不同，雙點突變體W140A/W272A水解(GlcNAc)6的最終產物 有GlcNAc 、(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和(GlcNAc)4，當底物(GlcNAc)6充足時迅速生成(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和(GlcNAc)4；(GlcNAc)6被 消 耗 完 后，W140A/W272A會繼續水解(GlcNAc)4，但水解效率明顯降低，說明W140A/W272A的外切活力明顯減弱，導致幾丁寡糖（(GlcNAc)3與(GlcNAc)4）的積累（圖5B）。

圖5 Chi304與W140A/W272A水解（GlcNAc）6分析Fig.5 Analysis of hydrolyzed （GlcNAc）6 by Chi304 and W140A/W272A

3 討論

本研究將幾丁質酶Chi304水解底物的2個關鍵芳香族氨基酸（色氨酸）定點突變為丙氨酸，突變體W140A、W272A與W140A/W272A水解底物幾丁質產物成分DP3/DP2較野生型分別提高23.3%、45.7%與80.0%，表明W140 與W272 為水解長鏈幾丁質的關鍵位點，具有調控幾丁質酶與底物結合的能力。

GH18 細菌幾丁質酶A 亞家族擁有與底物結合的深裂縫，表現出外切酶活力，能夠持續性地水解底物，其芳香族氨基酸在底物水解過程中發揮著重要作用。B 亞家族擁有較淺的底物結合裂縫，B 亞家族較A 亞家族含有更少的芳香族氨基酸殘基[26]。來源于Serratia marcescens的GH18家族的 ChiA、ChiB 和ChiC 中，ChiA 與ChiB 擁有1個深裂縫，表現出沿幾丁質長鏈滑動時切割二糖的持續性外切酶活性；ChiC有1個淺裂縫，表現出非持續性內切酶活性，可隨機切割幾丁質長鏈，但3 種酶最終的水解產物均以二乙酰殼二糖為主[27]。幾丁質酶Chi304 的蛋白結構顯示也有1 個深溝，水解底物膠體幾丁質的主要產物為 (GlcNAc)2及少量(GlcNAc)3和微量GlcNAc，同時也存在關鍵的芳香族氨基酸。

芳香族氨基酸對于酶的持續性水解發揮著關鍵作用，例如幾丁質酶AnChiB能夠降解黑曲霉菌絲體 廢 物產生(GlcNAc)2，發 現W106 和W118 是AnChiB 的重要活性位點[28]；將幾丁質酶SmChiA中的W167、W275 和F396 以及SmChiB 中的W97、W220和F190芳香族殘基（色氨酸殘基）突變為丙氨酸會導致能酶的結合自由能下降，使酶的持續性能力降低[29-30]。脂肪族氨基酸對幾丁質酶非持續性水解底物幾丁質以及(GlcNAc)6起著重要作用，例幾丁質酶NtChiV 和SmChiB 具有相似的酶與底物結合位點，但NtChiV 表現出非持續性水解底物，而SmChiB會持續性水解底物生成主要產物(GlcNAc)2，且在SmChiB的底物結合裂縫中發現的芳香族氨基酸殘基在NtChiV 中被脂肪族氨基酸殘基取代[25]。本研究中Chi304 存在2 個芳香族氨酸W140 與W272，這2 個色氨酸對于裂縫暴露面積的大小有直接作用，將其突變為丙氨酸后能夠暴露底物與酶的結合通道。突變體W140A與W272A水解膠體幾丁質的產物成分DP3/DP2明顯提升，分別較野生型Chi304 提升23.3%與45.7%；對于水解可溶性底物(GlcNAc)6，生成產物(GlcNAc)3的量較野生型分別提高3.2 與2.7 倍。色氨酸在幾丁質酶Chi304 持續性水解長鏈幾丁質生成(GlcNAc)2起著重要作用，將其突變為丙氨酸后，水解產物中(GlcNAc)3的量明顯提升。而芳香族氨基酸對于糖苷水解酶的持續性水解長鏈聚糖有普適性，例如在纖維素酶中芳香族氨基酸也能起到持續性外切纖維素的能力[31-32]。

近年來，雖然對幾丁質酶表達與應用的研究逐漸增多，但幾丁質的降解仍以化學或物理方法為主，一方面是由于幾丁質酶的熱穩定性差，另一方面是酶活力弱[10,33]。報道的內切幾丁質酶更少，典型的內切幾丁質酶ChiC1 水解幾丁質的產物仍是二乙酰殼二糖[34]。研究發現，芳香族氨基酸對于水解長鏈寡糖起重要作用，可以通過對關鍵芳香族氨基酸的定點突變，調控酶的內、外切活力，從而生產較高聚合度的幾丁寡糖，尤其是對于熱穩定性良好幾丁質酶的改造為生產幾丁寡糖（DP＞2）奠定了基礎。本研究發現W140 與W272為幾丁質酶Chi304 水解長鏈幾丁質的關鍵氨基酸，將其定點突變為丙氨酸后內、外切活力發生變化，為后續水解幾丁質生產幾丁寡糖（DP＞2）提供了新思路。