黏蛋白的結構與功能及其在腫瘤診斷治療中的應用前景

劉夢琪, 周小明, 張維寧

(江蘇大學醫學院,江蘇 鎮江 212013)

癌癥是導致人口死亡的主要原因之一。2020年中國新發癌癥病例約457萬,共導致約300萬人死亡[1]。手術、化療、放療等傳統治療方法給癌癥患者帶來的益處已趨于穩定峰值,但往往伴隨著不良反應,導致患者生活質量普遍下降,甚至由于不能耐受而被迫中斷治療。近年發展起來的癌癥免疫治療是通過重新啟動并維持腫瘤-免疫循環,恢復機體正常的抗腫瘤免疫反應以控制腫瘤的一種治療方法,具有針對性強、正常組織損傷小、患者易于接受等優勢。近年來,針對免疫治療的腫瘤抗原發掘得到飛速發展,確立了多種與癌癥相關的腫瘤抗原,并針對某些腫瘤抗原成功開發出免疫治療藥物。例如抗PD-1受體的納武利尤單抗、以血管生長因子受體(VEGFR)為靶點的貝伐單抗和針對細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)的抗體Ipilimumab[2]。其中,黏蛋白(mucins,MUC)被發現可用于腫瘤診斷的標志物或癌癥治療的潛在靶點。黏蛋白是一類高度糖基化的大分子糖蛋白,O型糖基化占該類分子質量的50%～90%。它們主要由胃腸道、呼吸道、卵巢及乳腺等器官中的上皮細胞分泌,是凝膠狀分泌物的關鍵成分,提供潤滑、細胞信號傳導以及化學屏障等生物學功能。在腫瘤組織中,黏蛋白往往過量表達或其糖基化結構出現異常[3],因此,黏蛋白的異?？捎糜诙喾N上皮來源惡性腫瘤的診斷,而針對黏蛋白靶點的腫瘤免疫治療研究在近年也取得重要進展。本文就黏蛋白的結構和功能及其在腫瘤診斷治療中的應用前景進行綜述。

1 分泌型黏蛋白和膜結合型黏蛋白及其體內分布

迄今已報道的黏蛋白有20余種,根據其結構與功能可分為分泌型黏蛋白和膜結合型黏蛋白兩類。分泌型黏蛋白包括MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6和MUC19等類型,由呼吸道或胃腸道上皮的杯狀細胞和分泌腺合成、分泌。這些分泌型黏蛋白具有富含半胱氨酸的N端和C端結構,能夠介導低聚反應,在呼吸道或胃腸道上皮的表面與水結合形成一層300～700 μm厚的黏液凝膠,起潤滑和保護腸道的作用[4]。膜結合型黏蛋白又稱細胞表面黏蛋白,主要包括MUC1、MUC3、MUC4、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC20、MUC21和MUC22等類型,是單次跨膜的Ⅰ型膜蛋白。膜結合型黏蛋白N端胞外區域具有串聯重復序列(TR)結構域、海膽精子蛋白-腸激酶-聚集蛋白(SEA)結構域或表皮生長因子(EGF)樣結構域。TR結構域包含不同數量的重復氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸)序列,這些絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸殘基是O-連接N-乙酰半乳糖胺的位點,以進一步啟動N-連接糖基化鏈反應[5]。SEA結構域的細胞膜外側附近存在一個高度保守的酶切割位點,跨膜黏蛋白的蛋白水解酶可將它們裂解成一個N端亞單位(包含TR結構域)和C端亞單位(包含跨膜和細胞質結構域)。EGF樣結構域與一些生長因子序列同源,并能與生長因子受體等相互作用。黏蛋白在人體組織中的表達如表1所示,分泌型黏蛋白MUC5AC和MUC6多在胃中表達,MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6在肝臟中表達,MUC5AC、MUC5B和MUC6在胰腺中表達。在腸道中,膜結合型黏蛋白MUC3、MUC4、MUC12、MUC13和MUC17通常成組性表達,而MUC1和MUC16在宿主受病毒感染或腫瘤時上調表達[6]。此外,MUC1和MUC3在肝臟中表達,MUC1、MUC3、MUC13和MUC20在胃中表達,MUC1、MUC3、MUC4、MUC11、MUC13和MUC20在肺中表達。

表1 黏蛋白在人體各組織中的表達

2 黏蛋白的結構

黏蛋白的分子量為0.5～20.0 MDa,正常黏蛋白具有相似的結構特征,蛋白質核心區域由兩個不同結構構成。一個是包含10～80個殘基形成多個串聯重復序列的中心糖基化區域,主要富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸,這些重復序列占氨基酸的60%以上。另一個是位于氨基和羧基末端的由氨基酸組成的球狀蛋白區域,通常具有較少串聯重復序列和O型糖基化及較高比例的半胱氨酸,散布于串聯重復序列之間。這些富含半胱氨酸的區域具有與von Willebrand因子C和D結構域及胱氨酸C末端結構域相似的序列。研究證明該區域通過形成二硫鍵參與二聚體反應,并能夠通過聚合二聚體形成多聚體結構[7]。此外,黏蛋白含大量N-乙酰氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、巖藻糖和半乳糖等碳水化合物的糖基化結構。一些寡糖鏈通過與絲氨酸和蘇氨酸羥基側鏈上的O-糖苷鍵排列在蛋白質核心區域周圍,共同形成黏蛋白分子。

黏蛋白能夠攜帶與腫瘤密切相關的異常O-聚糖,特別是在腫瘤惡化時,一些正常的抗原會被修飾成腫瘤特殊抗原。黏蛋白在多種腫瘤發生時表現為表達的上調、下調及糖結構的改變,O-聚糖的異常生物合成或結構的改變會導致合成的T、Tn或STn聚糖被縮短。sialy-Tn或sialy-T抗原就是常見的腫瘤惡化后由Tn或T抗原被唾液酸化修飾而形成的,70%以上的結腸癌都能發現Tn抗原的存在。特別是在腫瘤發生惡性轉化、轉移及預后不良反應時,T、Tn、STn聚糖和sLea、sLex等腫瘤細胞表位的表達就會異常增加[8]。因此,這些腫瘤特異聚糖的出現可被視為腫瘤標志物應用于腫瘤的臨床診斷。

3 黏蛋白的生物學功能

3.1 調節組織黏膜屏障

機體完整的黏膜屏障功能是體內微生物與宿主共生、抵御內毒素和病菌侵染組織的保障。當腸黏膜的免疫屏障功能異常時,腸腔內抗原物質就會激活免疫細胞,產生大量炎癥因子和細胞介質,黏蛋白此時能夠輔助腸黏膜進行免疫系統調節。黏蛋白MUC2在腸道中表達,通過其網狀結構和糖基側鏈黏附或包裹致病菌及內毒素等有害物質,并將它們隔離于腸上皮細胞之外,抵御有害物質的侵襲[7]。MUC2中大量的O型寡聚糖鏈骨架結構能夠提供與分泌型免疫球蛋白A及抗菌肽結合的免疫位點,重塑腸道屏障的免疫功能。在結腸外的黏液層中,黏蛋白是微生物菌群的生態結合位點,不僅能促進益生菌黏附并定植于腸腔,而且為益生菌提供生長所需的營養代謝物質,從而抑制有害菌的繁殖[9]。除了腸道以外,黏蛋白在胃、肝臟、肺和正常氣道中均有表達,MUC5AC是氣道防御的重要組成部分,但分泌過多會導致氣道阻塞,甚至由于氣道黏液過多引發致死性哮喘[10]。黏蛋白MUC19是位于眼表的黏蛋白,是構成淚膜中黏蛋白層的主要成分,具有親水性,可以鎖住水液層并穩定淚膜中的脂質成分。眼表中MUC19表達下調會導致干眼癥,增加眼表MUC19的合成和表達是恢復淚腺功能及治療干眼癥的重要前提[11]。

3.2 參與細胞信號傳導

MUC1(120～500 kDa)的多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞內段3部分組成,因此可作為膜表面受體參與信號傳導(圖1)。MUC1中的串聯重復域由20個氨基酸(PAPGSTAPPAHGVTSAPDTR)的重復序列組成,并包含110個氨基酸長度的SEA、短跨膜區和74個氨基酸的胞內區。其胞內結構域中的蛋白質結合基序可與糖原合成酶激酶3β、β-連環蛋白、生長因子受體結合蛋白2等相互作用[12]。此外,MUC1或MUC1/Y可能通過影響Sos蛋白參與調節Ras信號通路。MUC1胞內段的基因YTNP中的Tyr(Y)被磷酸化后可通過pYTNP與Grb-2上的SH2結構域結合,形成DF3/Grb-2復合物并通過Grb-2的SH3結構域與Sos蛋白結合,形成DF3/Grb-2/Sos復合物。同時,MUC1在胞外蛋白酶的降解下能夠釋放MUC1-N,從而改變MUC1-C的構象和配體狀態,隨后激活下游細胞傳導信號,例如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)和Wnt信號通路[13]。MUC1的胞內尾區還可以協同轉錄活化因子3、核轉錄因子κB、p53和β-連環蛋白,促進靶基因的表達,調控細胞增殖、生存和凋亡[14]。

VNTR:數目可變串聯重復序列;SEA:海膽精子蛋白-腸激酶-聚集蛋白結構域;ECD:細胞外結構域;TMD:跨膜結構域;CD:白細胞分化抗原;NIDO:巢蛋白樣結構域;AMOP:黏附相關結構域;vWF:血管性血友病因子;EGF:表皮生長因子

3.3 介導機體免疫

黏蛋白能與人體內可識別其空間結構表位的抗體形成免疫復合物,與B細胞的FcR結合,產生體液免疫應答并抑制細胞免疫應答的產生。此外,多年研究發現,黏蛋白及其聚糖通過與免疫細胞的凝集素結合發揮免疫效應。因此,由聚糖排列形成的黏蛋白結構域表面,對于與受體的結合能力就顯得很重要。單聚糖-蛋白質相互作用通常親和力較低,但蛋白質與聚糖表面的結合可能很快達到高親和力,黏蛋白及其聚糖能夠促使選擇蛋白招募免疫細胞至炎癥部位。Beatson等[15]發現唾液酸化的MUC1能與Siglec-9+髓樣細胞結合,引起慢性炎癥,并且唾液酸化的MUC1能夠在COX-2的作用下持續表達。此外,唾液酸化的MUC1誘導巨噬細胞呈現腫瘤相關巨噬細胞樣的表型,并增加配體PD-L1的表達。已有研究表明PD-L1表達下調和γ干擾素表達上調與MUC1-C被抑制密切相關。MUC-1的高表達還有利于腫瘤細胞抵御細胞損傷,尤其是凋亡相關因子自殺配體,腫瘤壞死因子相關性凋亡誘導配體以及T細胞分泌的顆粒酶和穿孔素引起的細胞損傷。髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)在促進疾病生長和免疫耐受中至關重要,當MDSCs發生抑制自體T細胞反應時,T細胞增殖減少并且Th1向Th2表型轉變[16-17]。Pyzer等[18]發現MUC1是腫瘤來源的胞外囊泡介導MDSC擴張的關鍵驅動因子,MUC1通過對細胞周期蛋白的下游作用,誘導MDSC的增殖,使細胞外囊泡中的c-myc基因表達增加。然而,黏蛋白是否具有直接的免疫作用仍需進一步的研究與驗證。

4 黏蛋白在腫瘤診斷和治療中的應用

4.1 癌癥診斷與預后評估

黏蛋白的差異表達與潛在腫瘤的形成具有一定的相關性,黏蛋白作為惡性腫瘤的標志物已被廣泛用于多種腫瘤的臨床診斷和預后評估。MUC1在肺癌中高表達并且其結構和生化特性發生改變,參與腫瘤的發生、增殖和轉移,可作為識別和監測肺癌的生物標志物[12]。研究發現,MUC1介導產生結締組織生長因子、血小板衍生生長因子,參與STAT3、PI3K及NF-κB通路,并通過β-catenin/TCF4通路激活MYC癌基因,從而增強腫瘤細胞的增殖能力,促進腫瘤的發展[14]。MUC1在肺鱗癌和肺腺癌患者血及癌組織中表達水平升高,血MUC1對肺鱗癌和肺腺癌的診斷敏感度為52.94%和61.54%,特異度為100%和95%[19]。非小細胞肺癌患者的外周血MUC1mRNA水平顯著升高,其對非小細胞肺癌的診斷靈敏度為68.8%,特異度為94.4%,聯合cyfra21-1可將靈敏度提高至87.5%[20]。此外,MUC1的表達對評價上皮源性腫瘤的預后具有指導意義,MUC1過表達顯著影響手術和非手術治療的肺癌患者的總生存期和無進展生存期,高表達的MUC1提示潛在的預后不良[21]。

MUC4(550～930 kDa)可以以膜結合型和分泌型兩種形式存在,GDPH位點的蛋白水解將MUC4分解成MUC4α和MUC4β兩個亞基。MUC4α由一個寡糖側鏈修飾的富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸殘基的VNTR區域組成,VNTR區域下游存在黏著相關結構域和類巢蛋白結構域兩個部分。MUC4β包含1個血管性血友病因子結構域、3個類表皮生長因子樣結構域、1個跨膜蛋白和1段22個氨基酸構成的胞內片段。其中,NIDO、AMOP和vWF是MUC4特有的結構域。MUC4在正常胰腺中檢測不到,但在胰腺癌的癌前病變中可檢測到,其表達水平與胰腺癌發展程度呈正相關。此外,MUC4可以與表達E-選擇素和P-選擇素的內皮細胞相互作用,還可與循環中的半乳糖苷-3結合,增強MUC4與內皮細胞的相互作用,導致內皮細胞之間的黏附和腫瘤的轉移[22-23]。Urey等[24]發現,90%以上的胰腺癌組織樣本呈MUC4陽性表達,且相較于組織樣本中高表達MUC4的腫瘤患者而言,低表達MUC4的腫瘤患者的長期生存率更高。在胰腺癌患者接受吉西他濱治療后發現,MUC4的低表達與患者的良好預后高度相關,表明MUC4的表達水平可輔助判斷腫瘤治療后的預后情況。

膜結合型黏蛋白MUC16是卵巢癌中過度表達的一種腫瘤特異性抗原,目前是臨床上診斷卵巢癌應用最為廣泛的重要血清生物標志物[25]。MUC16(1.5～5.0 MDa)常表達于眼表、呼吸道和子宮內膜組織(特別是在腺體和上皮細胞中,以及宮頸黏液),含約14 000個氨基酸,包含N端結構域(MUC16-N)、串聯重復結構域(MUC16-TR)和C端結構域(MUC16-C)三個主要結構域。其N-末端結構域在一個長約12 000個氨基酸的區域內,包含多個富含絲氨酸的區域,該區域僅為O-糖基化。TR結構域包含156個氨基酸的12～60個重復序列,具有散布的SEA結構域,其中包含O-連接和N-連接的糖基化位點。MUC16的C端結構域包括一個胞外結構域、短跨膜區和一個32個氨基酸的胞內結構域。研究發現,80%以上卵巢癌患者其MUC16由于胞內近膜側被磷酸化,胞外部分會從細胞表面脫落釋放入血或胞外基質,造成MUC16表達水平較高[26]。動物實驗研究表明,N端敲除后的MUC16轉載入卵巢癌細胞會刺激癌細胞黏附依賴的克隆形成,增強黏附依賴的生長時間和卵巢癌細胞侵襲和轉移的能力,導致裸鼠皮下成瘤及瘤體生長[27]。利用MUC16的動態變化監測療效已用于臨床,卵巢癌患者血清中MUC16水平是化療方案的有效依據,可作為患者前3次化療結束后的評價指標[28]。

4.2 基于黏蛋白的癌癥靶向治療

腫瘤免疫逃逸指腫瘤細胞逃避機體免疫系統識別和攻擊,從而在機體內生存和增殖。免疫治療能夠恢復身體的免疫系統對抗腫瘤細胞,以促進對腫瘤細胞的抑制?；陴さ鞍椎陌┌Y靶向治療研究進展如表2所示。低糖基化MUC1可暴露腫瘤抗原表位,下調MUC1可抑制腫瘤細胞增殖和轉移并促進癌細胞凋亡[29]。TG4010疫苗是一種重組修飾牛痘病毒懸濁液,可編碼MUC1腫瘤相關抗原和IL-2,從而誘導或放大針對腫瘤的細胞免疫應答。在Quoix等[30]進行的一項隨機、雙盲、安慰劑對照的臨床試驗中,222例患者分別接受了TG4010疫苗、安慰劑及化療干預,結果表明,TG4010組和安慰劑組的中位無進展生存期分別為5.9個月和5.1個月。L-BLP25脂質體疫苗是MUC1抗原特異性的長肽脂質體疫苗,臨床前及Ⅰ期研究表明其能夠激活MUC1抗原特異性T細胞并抑制MUC1轉基因小鼠肺部腫瘤的生長,明顯延長了對疫苗產生免疫應答的肺癌患者的生存期。全球多中心Ⅲ期臨床試驗納入了1 513例穩定或者臨床緩解的Ⅲ期非小細胞肺癌患者,L-BLP25與安慰劑組的中位總生存期為25.6個月和22.3個月。亞組分析顯示在既往接受同步放化療的患者中,L-BLP25較安慰劑組的中位生存期延長了10.2個月(P=0.016),表明L-BLP25可作為維持治療肺癌的策略[31]。樹突細胞是一種具有分支或樹突狀形態及吞噬功能,能夠遞呈抗原的細胞。樹突細胞疫苗是利用樹突細胞的抗原遞呈能力,將癌細胞的抗原特征遞呈給T細胞,活化T細胞對癌細胞發起攻擊。在一項研究中,Liu等[32]發現利用開發的納米顆粒遞送系統使荷瘤小鼠接受MUC1抗原肽沖擊樹突細胞的療法后,與對照組相比,小鼠特異性T細胞的免疫應答得到增強,抑制了腫瘤的生長。此外,Ota等[33]發現晚期或復發胰腺癌患者在接受MUC1抗原肽沖擊樹突細胞治療后可誘導細胞免疫反應,并有助于逆轉細胞的免疫抑制作用。Scheid等[34]納入16名非轉移性去勢抵抗性前列腺癌患者接受Tn-MUC1糖肽樹突細胞疫苗治療,有11名患者的前列腺特異性抗原的倍增時間顯著改善(P=0.037)。免疫反應分析發現,在7名接受評估的患者中,有5名患者出現了顯著的Tn-MUC1特異性CD4+和(或)CD8+T細胞內細胞因子反應,表明MUC1能夠誘導顯著的T細胞反應,且具有生物活性。

表2 黏蛋白作為靶點的癌癥治療進展

研究發現MUC4蛋白具有抑制細胞與基質連接,幫助腫瘤細胞逃避免疫細胞攻擊,促進腫瘤細胞生長和轉移,抑制細胞凋亡等生物學功能,在腫瘤的發生發展過程中起著重要作用[35-37]。目前可以利用生物信息學技術預測并鑒定腫瘤抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位,T細胞表位預測旨在鑒定抗原內能夠刺激CD4+或CD8+T細胞的最短肽,并且在產生抗原合成肽的試驗中被證實。Wu等[35]利用數據庫預測并篩選出P01202(1125LLLGVGTFV1133)、P01203(498WLLEPHDAI506)、P01204(1126LLGVGTFVV1134)、P01205(1119GALGGLLLL1124)和P01206(944GTLDMRAFL952)共5個表位肽,其中P01204表位肽誘導的CTL對人體結腸癌細胞HCT-116具有特異性殺傷作用。瑪依努爾等[36]通過生物信息學分析預測MUC4為miR-150的潛在靶點,MUC4 3′-UTR是miR-150的假定結合位點。miR-150過表達與細胞自噬相關,MUC4表達隨著miR-150過表達顯著降低,SiHa細胞增殖、遷移侵襲能力顯著降低且細胞凋亡增加。

FDA目前已批準將MUC16作為診斷依據,MUC16目前是臨床上應用最為廣泛的卵巢癌診斷標志物。Oregovomab是首個針對MUC16的臨床試驗單克隆抗體藥物,已用于原發性卵巢癌患者的用藥。Oregovomab具有高親和能力,能夠結合MUC16的糖基化區域并且通過抗獨特型抗體誘導間接免疫應答。在一個納入97例Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌患者的治療中,Oregovomab聯合應用卡鉑與紫杉醇治療組患者的無進展生存期為41.8個月,單獨紫杉醇治療患者的無進展生存期為12.2個月(P=0.003,HR=0.46,95%CI:0.28～0.70)[38]。在紫杉醇與Oregovomab聯合給藥后,外周血中MUC16-IFN-γ+CD8+T淋巴細胞數量增加,Oregovomab單抗的免疫應答被激活[39]。Abagovomab是一種針對腫瘤相關抗原CA125的鼠源性單克隆抗體,能刺激宿主產生細胞毒性免疫反應抑制腫瘤細胞。在多中心臨床Ⅲ期研究中,Sabbatini等[40]納入了888名卵巢癌患者進行Abagovomab的雙盲、安慰劑對照試驗,80.9%的患者在第3個治療周期后,癌抗原CA125≤35 U/mL,治療組無復發生存風險比為1.099(95%CI:0.919～1.315,P=0.301)[39]。DMUC5754A是一種抗體-藥物偶聯物,由一種人源性抗Nectin-4抗體與抗有絲分裂藥物一甲基澳瑞他汀E(MMAE)結合,結合到癌細胞表面的MUC16上,然后通過網格蛋白介導的內吞作用使偶聯物-抗原復合物被內化,降解溶酶體后釋放細胞毒性。由于具有毒性,其本身不能作為藥物使用,通常與一種單克隆抗體(mAb)相連,mAb將其導向癌細胞,MMAE破壞微管,誘導腫瘤細胞凋亡。DMUC5754A還可能通過信號轉導抑制、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)發揮抗腫瘤作用[41]。

5 展望

隨著對黏蛋白研究的深入,黏蛋白分子結構、功能差異以及正常組織和腫瘤組織中的表達差異逐漸被了解,針對黏蛋白的開發主要是以黏蛋白為靶點的腫瘤免疫治療。黏蛋白的應用多為腫瘤的監測及預后診斷,對黏蛋白作為靶點的藥物開發仍然處在早期。目前黏蛋白相關疫苗正處于臨床試驗階段,其有望在未來腫瘤的綜合治療中進一步發揮其優勢。為了開發更有效的基于黏蛋白的腫瘤治療策略,需要更好地理解黏蛋白異常糖基化、剪接變體、致癌信號級聯和互作結合蛋白的內在機制。