規?；Z場主要病毒核酸檢測結果與分析

邵震，刁有祥

規模化鵝場主要病毒核酸檢測結果與分析

邵震，刁有祥

山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271000

【目的】經長期對中國國內各省市的規模化鵝場常見病毒性疫病核酸檢出率進行調查，發現國內許多規?；Z場均可同時檢出多種病毒核酸，并且這種現象非常普遍，鑒于目前國內關于規模化鵝場多種病毒性疫病核酸同時檢出的相關數據較為匱乏，論文旨在了解規?；Z場多種病毒性疫病核酸同時檢出的情況并進行分析，為規模化鵝場病毒性疫病的防控提供理論指導和科學依據。【方法】2021年5—10月，自山東、黑龍江、四川、吉林、廣西、河南、安徽、遼寧、河北、貴州、湖南及內蒙古等省市的47個規模化鵝場采集737份病料，對其采用普通PCR及RT-PCR方法進行番鴨呼腸孤病毒（muscovy duck reovirus, MDRV）、鴨呼腸孤病毒（duck reovirus, DRV）、鵝星狀病毒(goose astroviruses, GAstV)、禽腺病毒（fowl adenovirus, FAdV）、禽網狀內皮增生病毒（reticuloendotheliosis virus, REV ）、新城疫病毒（newcastle disease, ND）、鵝細小病毒(goose parvovirus, GPV)、鵝圓環病毒(goose circovirus, GoCV)、鵝出血性多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus, GHPV)、坦布蘇病毒（tembusu virus, TMUV）及H9亞型禽流感病毒（avian influenza virus H9, H9-AIV）等11種規?；Z場常見病毒性疫病的檢測。每份病料剖取完整的肝臟、脾臟、肺臟及腎臟，利用Trizol 法提取總 RNA；以總RNA為模板逆轉錄合成cDNA的一條鏈，而后以cDNA為模板繼續擴增獲得完整的cDNA，隨后以該cDNA為模板利用番鴨呼腸孤病毒、鴨呼腸孤病毒、鵝星狀病毒、禽腺病毒、禽網狀內皮增生性病毒、新城疫病毒、鵝細小病毒、鵝圓環病毒、鵝出血性多瘤病毒、坦布蘇病毒及H9亞型禽流感病毒的特異性引物，通過普通PCR反應擴增目的片段；所有擴增片段均進行瓊脂糖凝膠電泳，對部分陽性樣品進行測序；將所獲得的測序結果與GenBank上發表的相應病毒基因序列進行比較，應用MEGA 6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining, NJ）繪制系統發育進化樹進行分析?！窘Y果】番鴨呼腸孤病毒、鴨呼腸孤病毒、鵝星狀病毒、禽腺病毒、禽網狀內皮增生性病毒、新城疫病毒、鵝細小病毒、鵝圓環病毒、鵝出血性多瘤病毒、坦布蘇病毒及H9亞型禽流感病毒感染情況檢測結果顯示，GAstV核酸檢出率最高，為58.21%；REV及NDV核酸檢出率最低，分別為1.36%及1.50%；鵝群不同程度上均可同時檢出多種病毒核酸，尤其以2種或3種病毒核酸同時檢出的情況較為普遍，占樣品總數的67.44%。兩種病毒核酸同時檢出率中GAstV與GoCV同時檢出所占比例最大，為18.44%；3種病毒核酸同時檢出率中MDRV、GAstV及GPV同時檢出所占比例最大，為36.28%?！窘Y論】明確了我國規?；Z場可以同時檢測到多種病毒核酸這一特征，這可能是我國規?；Z場病毒性疫病復雜化和防控難度加大的重要原因之一。

規?；Z場；核酸檢測；遺傳進化分析

0 引言

【研究意義】中國是世界第一養鵝大國，2020年我國商品鵝出欄量達6.39億只， 2021年我國商品鵝出欄量達6.61億只。但隨著養殖規模和密度的不斷增加，鵝病的發生率大幅上升，經?？稍诓※Z體內檢測出多種病毒核酸，鵝病的預防、診斷和控制面臨著重大挑戰。因此，加強對規?；Z場多種病毒性疫病核酸的檢測，可為了解鵝病的流行情況提供流行病學資料，為鵝病的防控提供理論依據。【前人研究進展】 CHEN等[1]為了解GAstV的流行情況，于2018年1月至2019年4月從湖北、安徽、河南等地的7個規?；Z場中收集了165份病料。檢測結果顯示，GAstV檢出陽性的病料中，均可以同時檢出鵝細小病毒（GPV）及番鴨呼腸孤病毒（MDRV）；TING等[2]調查了臺灣40個規?；Z場，結果顯示44.6%的雛鵝和66.7%的成年鵝群中均可同時檢出GPV與GoCV核酸；LIU等[3]對采集自中國12個規?；Z場的病料進行了GPV、FAdV、TMUV、GHPV等病毒的檢測，檢測結果顯示這些雛鵝皆可同時檢測出GPV和GAstV病毒核酸，且GPV的存在會使痛風加重。在此研究基礎上，WANG等認為雛鵝痛風是由GAstV與其他病毒共同作用導致的?！颈狙芯壳腥朦c】目前規?；Z場大部分可同時檢出多種病毒核酸，對我國養鵝業的危害較大。為了解當前我國規模化鵝場中病毒性疫病的流行情況，筆者從華東、華南、華中、東北、西南等地區的規模化鵝場采集病料，對規模化鵝場新型鵝星狀病毒（GAstV）、鴨呼腸孤病毒（DRV）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、鵝細小病毒[4]（GPV）、鵝圓環病毒（GoCV）、禽腺病毒（FAdV）、坦布蘇病毒[5-6]（TMUV）、禽流感H9亞型病毒（AIV-H9N2）、鵝多瘤病毒（GHPV）、新城疫病毒（NDV）、禽網狀內皮增生病毒（REV）等常見病毒性疫病的核酸檢出情況進行調查，并對代表毒株測序、分析?！緮M解決的關鍵問題】確定規模化鵝場常見病毒性疫病病毒核酸的同時檢出情況，為鵝病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集

2021年5—10月自山東、黑龍江、四川、吉林、廣西、河南、安徽、遼寧、河北、貴州、湖南及內蒙古等省市的47個規?；Z場采集737份病料。

1.2 主要試劑及儀器

Tris平衡酚、SDS、蛋白酶K購自北京索來寶生物科技有限公司；RNA 提取試劑 Trizol Reagent 購自北京全式金生物技術有限公司。高速冷凍離心機（美國貝克曼爾有限公司），PCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司）。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank已發表的病毒基因序列設計特異性引物。GPV引物參考登錄號NC_001701.1的GPV毒株VP3基因設計；GoCV引物參考GoCV/375/GD/2020（登錄號MT831941.1）毒株的V1基因設計；GHPV引物參考JY141Ma（登錄號MG670535.1）毒株的Large T基因設計；MDRV引物參考ZJ99（登錄號AY619690.1）毒株的σC基因設計；H9-AIV引物參考HU10-1708（登錄號為LC500398.1）毒株的Segment 4設計。引物序列見表1，引物由青島華大基因公司合成。

表1 引物序列

1.4 核酸提取

采用Trizol法進行RNA的提?。喝〗M織置于離心管中加入Trizol；離心棄沉淀；加入氯仿靜置；離心吸取水相；加入異丙醇靜置；離心棄上清；加入乙醇，離心棄上清；晾管；加入30 μL RNA-free ddH2O溶解。

采用酚—氯仿法提取DNA：取組織液置于離心管中加入蛋白酶K，56 ℃水??；加入平衡酚與氯仿；離心吸取上清液；加入無水乙醇，-20 ℃沉淀；離心加入冷乙醇；離心，棄去乙醇；晾干后ddH2O溶解沉淀。

1.5 （RT-）PCR擴增及序列分析

反轉錄體系按照下列比例配制：dNTP Mix，4 μL；Primer Mix，2 μL；RNA Template，7 μL；5×RT Buffer，4 μL；DTT，2 μL；HiFiScript，1 μL 。cDNA按照下列程序合成：42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。

PCR擴增體系如下：DNA或cDNA 1 μl；上、下游引物各1 μl；2×Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR程序：94 ℃預變性10 min；94 ℃ 30 s，退火溫度見表1 30 s，72 ℃延伸、延伸時間根據各片段長度設定，共35個循環；72 ℃終末延伸 10 min。取7 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳并挑選PCR產物送至青島擎科公司測序。

1.6 遺傳進化分析

根據測序結果采用MEGA 6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining），p-distance算法，Bootstrap 1000次繪制遺傳進化樹，進行遺傳進化分析。

2 結果

從12個省共采集病料737份，病料樣品信息見表2—4。

表2 病料樣品信息

2.1 不同病原檢測結果

不同病原檢測結果見表5。結果顯示，GAstV檢出最多，為429份，陽性檢出率達58.21%；其次為DRV和MDRV，檢出量分別為319份和288份，陽性檢出率為43.28%和39.08%；REV檢出量最少，為10份，陽性檢出率為1.36%。結果表明，GAstV、DRV及MDRV在規?；Z場中流行最為廣泛。

2.2 不同病原核酸的檢測結果

不同病原核酸同時檢出的結果見表6。結果顯示，僅100份樣品只檢出唯一一種病毒核酸，所占比例13.7%；多達632份樣品同時檢測出2種或2種以上病毒核酸，所占比例高達85.75%，由此表明大部分規?；Z場均可同時檢出2種或2種以上病毒核酸。在多種病毒核酸同時檢出的病例中，同時檢出2種病毒核酸樣品數為282份，所占比例為38.26%；同時檢出3種病毒核酸樣品數為215份，所占比例為29.17%；同時檢出4種病毒核酸樣品數為111份，所占比例為15.06%。結果表明，大部分鵝場均可同時檢出兩種或3種病毒核酸。

表3 不同月份病料采集情況

表4 不同日齡段病料情況

表5 不同病毒檢測

表6 不同病原核酸的檢測

2.2.1 不同病原單一病毒核酸檢測 不同病原單一病毒核酸檢測結果見表7。結果顯示，以GAstV的檢出率最高，達42.00%，之后依次為GoCV和DRV，檢出率分別為27.00%和14.00%。

表7 不同病原單一病毒核酸檢測

2.2.2 不同病原雙重病毒核酸檢測 不同病原雙重病毒核酸檢測結果見表8。結果顯示，GAstV與GoCV 2種病毒的混合檢出率最高，為18.44%；其次是DRV與GoCV，檢出率為16.67%。由于GoCV是免疫抑制性病原，猜測當鵝群感染GoCV后，鵝群免疫力下降，甚至疫苗免疫失敗，從而繼發感染其他病原，造成較大損失。

2.2.3 不同病原三重病毒核酸檢測 不同病原三重病毒核酸檢測結果見表9。結果顯示，MDRV、GAstV及GPV的檢出率最高，為25.28%。其中約94.88%的三重病毒核酸檢測出了MDRV或DRV，因此需要重視水禽呼腸孤類病毒對規?；Z場的威脅。

2.2.4 不同病原四重病毒核酸檢測 不同病原四重病毒核酸檢測結果見表10。結果顯示，MDRV、DRV、FAdV及GPV檢出率最高，為22.52%。

2.2.5 不同病原五重病毒核酸檢測 不同病原五重病毒核酸檢測結果見表11。結果顯示，MDRV、DRV、GPV、GAstV及FAdV檢出率最高，為33.33%。

表8 不同病原雙重病毒核酸檢測

2.3 不同日齡鵝群病毒核酸檢測

不同日齡段鵝群病毒核酸檢測結果表明（圖1）。不同日齡段的鵝均可檢出病毒核酸，但情況各異。MDRV在不同日齡段鵝體內的檢出率均較高，以青年鵝群最高；DRV、FAdV在青年鵝群檢出數最多，雛鵝和成年鵝的檢出量相近；GAstV在雛鵝中檢出量遠高于青年鵝和成年鵝；REV、GHPV在不同日齡段鵝群中檢出量相似；NDV只在雛鵝中檢出；GPV主要在雛鵝和青年鵝中檢出，成年鵝檢出較少；GoCV主要從雛鵝中檢出，青年鵝和成年鵝也有檢出，但相對較少；TMUV病毒核酸主要從成年鵝體內檢出。

2.4 不同季節鵝群的檢測結果

為調查規?；Z場流行病與季節的關系，對不同季節規?；Z場病毒性疫病進行檢測。檢測結果表明（表12），H9亞型禽流感病毒在氣溫變化幅度較大的季節（春季）檢出數量更多，呈現明顯的季節規律； TMUV感染主要發生在夏季。

表9 不同病原三重病毒核酸檢測結果

2.5 不同病原主要基因遺傳變異分析

2.5.1 GPV VP3基因遺傳變異分析 GPV VP3基因在不同來源GPV毒株之間的變異情況較為保守。對GPV VP3基因進行遺傳變異分析，由圖2可見，GPV分離株LC2021（分離自2021.07.19從山東省聊城市陽谷縣采集的棉拭子中）和HD2021（分離自2021.05.13從河北省邯鄲市采集的脾臟中）與參考毒株GPV HB15株的遺傳關系最近，與MDPV DY株、PT株處于同一分支，但與中國大陸GPV疫苗株（GD，SYG61及SYG26-35）處于完全不同的分支[7]，有較遠的遺傳距離[8]。

圖1 不同日齡段檢測結果

表10 不同病原四重病毒核酸檢測結果

表11 不同病原五重病毒核酸檢測結果

2.5.2 GoCV V1基因遺傳變異分析 由圖3可見，GoCV分離株ZB2021（分離自2021.09.18從山東省淄博市沂源縣采集的脾臟中）、YG2021（分離自2021.07.19從山東省聊城市陽谷縣采集的棉拭子中）與鵝源GoCV大陸參考分離株處于同一個小分支，與鵝源中國臺灣參考分離株處于完全不同的分支上，表明大陸鵝源GoCV分離株之間親緣關系較近，但與臺灣GoCV鵝源分離株親緣關系較遠。

表12 不同季節檢測結果

2.5.3 GHPV Large T基因遺傳變異分析 對GHPV Large T基因進行遺傳變異分析，結果見圖4，GHPV分離株XC2021（分離自2021.05.10從河南省項城市采集的脾臟中）與世界各地（中國、匈牙利、法國）水禽源GHPV分離株（鵝源、番鴨源、櫻桃谷鴨源、北京鴨源及鴨源）均處于同一分支，與非水禽源的GHPV毒株處于不同分支上。

圖2 基于GPV VP3基因的遺傳進化圖

圖3 基于GoCV V1基因的遺傳進化圖

2.5.4 MDRV σC基因遺傳變異分析 由圖5可見，分離株SDDZ2021（分離自2021.06.19從山東省德州市采集的肝臟中）與MDRV參考毒株匯為獨立分支，與DRV及ARV參考毒株處于不同分支，相互之間遺傳距離較遠。SDDZ2021與MDRV中國經典分離株ZJ2000M[9]遺傳距離最近。

3 討論

H9-AIV、NDV、TMUV、GoCV及GPV病毒是威脅規模化鵝場的重要病原，給其帶來較為嚴重的經濟損失[10-13]。這些病毒如果同時或先后感染可造成鵝群多樣的臨床癥狀和病理變化，使鵝病防控形勢日益嚴峻。因此，通過調查了解規模化鵝場病毒性疫病的共感染情況，可為鵝病防控提供理論依據。

3.1 調查的規模化鵝場以同時檢出2種或3種病毒核酸為主

本研究對我國部分地區規?；Z場病毒性疫病核酸的同時檢出情況進行了初步調查，結果表明，僅僅檢出一種病毒核酸的情況較少，以同時檢出多種病毒核酸為主且類型復雜。其中以同時檢出2種病毒核酸的情況居多，尤其以GAstV與GoCV所占比例最大（18.44%）；同時檢出3種病毒核酸以MDRV、GAstV、GPV居多；同時檢出4種病毒核酸以MDRV、DRV、GPV、FAdV較為常見；同時檢出5種病毒核酸的情況較少。

筆者認為諸如GoCV、GHPV及MDRV等免疫抑制性病毒的感染是我國部分規?；Z場檢測到多種病毒核酸同時存在的主要原因之一。免疫抑制性病毒的存在會大大降低鵝群的群體免疫力，使鵝群更容易感染常見的流行病，同時增加了鵝群感染新發疫病的風險。免疫抑制性病毒癥狀通常易被繼發病毒癥狀掩蓋，造成診療人員的誤判、漏判，使診療的方案、物力、人力向繼發病毒傾斜，忽視對免疫抑制性病毒的診療，導致繼發感染難以凈化完全，鵝群反復感染、反復治療，體內始終共存多種病毒核酸。其次，筆者查閱病料采集記錄詳情本后發現，有些病料的來源鵝場剛剛進行過疫苗接種，疫苗毒株核酸的存在也可能是此次調查檢測出多種病毒核酸的原因之一。同時，筆者通過電話回訪發現，一些規?；Z場的種鵝來源于曾經發生過多重病毒共感染的疫區或疫源國，垂直、交叉感染情況較為嚴重，一部分雛鵝出生即死，死亡雛鵝體內可檢測到多種病毒核酸；一部分雛鵝通過加強免疫及治療勉強存活，剖檢后也可檢測到多種病毒核酸，筆者推測這也是本次調查檢測出多種病毒核酸的原因之一。

圖4 基于GHPV Large T基因的遺傳進化圖

圖5 基于σC基因的遺傳進化圖

據此，針對本次調查中鵝群檢測出多種病毒核酸共存這一事實，筆者認為如果不能完全自繁自養，做好病毒凈化，首先應做好引種檢疫關，堅決不從發生過多種病毒流行的疫源地引種，避免垂直傳播和交叉感染的發生。其次，規模化鵝場發生感染及死亡后，不能僅從癥狀推導疾病，應盡可能進行病毒核酸的檢測，有條件的情況下還應針對檢測出的病毒進行分離培養及易感動物的回歸實驗，以此排除疫苗毒株病毒核酸的干擾。明確實際感染的病毒種類，以此制定科學合理的治療方案，循序漸進，標本兼治，避免遺漏、忽略任何一種病毒，尤其是免疫抑制性病毒。同時，筆者認為良好的飼養管理、全進全出及完善的消殺措施是重中之重，以此增強和保障鵝群的整體免疫力處于較高的水平。對于檢測出的多種共存病毒，應針對性預防，如TMUV的重要傳播媒介是蚊蟲，則規?；Z場夏季應做好滅蚊、防蚊工作；GAstV的重要傳播媒介是野生水禽、涉禽，則規模化鵝場要做好隔離措施，選址盡量避開候鳥遷徙路線，水源盡可能潔凈、獨立，以此避免野生水禽、涉禽與鵝群發生直接或間接的接觸。

3.2 共同檢出多種病毒核酸與更嚴重的后果聯系密切

本研究未檢出只有GPV病毒核酸單一存在的情況，但GPV的檢出率卻高達35.55%，說明GPV以與其他病毒核酸共同檢出為主，其中GPV與MDRV、GAstV、GoCV及FAdV共同檢出的情況居多。WU等[2]調查了臺灣規?；Z場GPV與GoCV的檢出情況，調查結果顯示約12 000只鵝被感染，GPV與GoCV的同步檢出率為53.26%，發病率為70%—80%，死亡率為20%—30%，遠高于GPV或GoCV單一入侵所造成的發病率或死亡率[14]；LIU等[3]調查了中國12個規模化鵝場，結果顯示GAstV與GPV的同步檢出率達到96.15%，遠遠超過GAstV或GPV的單一檢出率，表明在GPV存在的條件下，規模化鵝場鵝群檢出GAstV的概率大幅上升。NIU等[15]調查了中國11個省規?；Z場的GPV檢出情況，發現GPV與GoCV的同步檢出率為21.7%；同時許多被調查的規?；Z場并未流行過GPV，說明這些鵝場或許存在著GPV的隱性感染或垂直感染。因此除了常規的疫苗防控外，對種鵝群進行GPV的凈化同樣非常重要。此外，以往的研究報道了GPV與MDPV之間存在著明顯的基因重組，并且已經出現了可導致鴨喙萎縮與侏儒癥（BADS）的新型鴨源GPV，這表明GPV已可以跨宿主感染鴨群[8, 16-18]。

H9亞型AIV對鵝為低致病性[19]，但當H9-AIV與其他病原體共同入侵宿主時，會使鵝群的死亡率大大增加。LIN等[20]調查結果顯示鵝群單一檢出H9-AIV時，發病率僅為10%，且無死亡現象，胸腺也未見明顯病理變化，但當H9-AIV與MDRV共同檢出后，鵝群發病率驟升至90%，死亡率攀升至70%，胸腺萎縮且出現局部壞死，表明H9-AIV與MDRV協同配合降低鵝群免疫力；HASSAN等[21]調查了埃及H9-AIV的檢出情況，他們發現當H9-AIV與傳染性支氣管炎病毒（IBV）同步檢出時，不僅H9-AIV的臨床癥狀加重[22]，IBV亦出現致死病例；GOWTHAMAN等[23]調查了印度南部37個農場的NDV與H9-AIV的共同檢出情況，結果顯示H9-AIV與NDV的共同檢出率可達100%，死亡率比NDV、H9單一檢出的情況皆高出30%以上，疫病持續時間多出4—6周，并繼發大腸桿菌和支原體感染[24]；YU等[25]調查了山東省H9-AIV與I群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）共同檢出的情況，結果顯示H9-AIV與FAdV-4同步檢出率為24.30%，由此推測免疫抑制性疫病會破壞群體免疫，為其他病原入侵提供有利條件。本研究H9-AIV于春季檢出數量最多，原因可能與晝夜溫差過大、天氣寒冷導致鵝抵抗力下降有關。H9-AIV雛鵝檢出數量較多，但死亡率卻很低。成年鵝檢出數量和死亡率相對較低，可能由于成年鵝的免疫系統發育成熟，可以抵抗H9-AIV的入侵[26]。但成年鵝可能出現隱性帶毒的情況，尤其當H9-AIV與其他病毒共同入侵宿主機體時，可使鵝群的死亡率大幅增加。

NDV對鵝同樣具有致病性，且發病率和死亡率居高不下。雛鵝更容易檢出NDV，青年鵝和成年鵝NDV檢出數量較少，可能由于青年鵝和成年鵝免疫系統較為完善。NDV大部分是單一檢出，可能與其發病急、死亡率高有關；NDV多與H9-AIV共同檢出，兩者相互作用可使鵝群發病率升高。因此合理的免疫計劃、標準的飼養管理可以最大程度降低NDV的危害。

本研究GHPV檢出率僅為3.12%，尚未對我國鵝群構成威脅[27]，但GHPV病毒在歐洲是非常重要的傳染病原體之一[28-29]。規模化鵝場一旦檢出GHPV病毒核酸就很難徹底凈化[28, 30-31]。因此從國外引種、購買活鵝或鵝制品時要做好檢驗檢疫，從源頭上阻止GHPV傳入我國。同時加強飼養管理，避免水禽混養、家禽野禽接觸，并進行定期的徹底消毒，以上措施可在一定程度上防控GHPV對規?；Z場造成危害。

TMUV入侵宿主機體具有明顯的季節特征，夏季檢出數量較多，因為夏季蚊蟲較多利于該種蟲媒病毒傳播[32]，因此在夏季規?；Z場應注意滅蚊滅蟲，從傳播途徑上減少鵝群接觸TMUV的幾率。TANG等[33]在規?；Z場周邊的麻雀體內檢測到TMUV，以此提出麻雀可作為TMUV的傳播媒介，這一點提示我們要做好規?；Z場周邊的防鳥措施，嚴禁家鵝與野禽、野鳥接觸。本研究TMUV以與其他病毒核酸的共同檢出為主（92.11%），其中又以TMUV、MDRV雙重病毒核酸檢出數量最多，2種病毒之間可能存在協同配合作用。因此，對TMUV的防控不能局限于對鵝群進行免疫接種，同時應加強飼養管理、建立健全生物安全綜合防控體系。

GoCV病毒是一種免疫抑制性病毒[34]，鵝感染GoCV后會繼發其他病原感染，使其臨床癥狀加重、復雜，導致發病率和死亡率急劇升高，是我國規?；Z場病毒性疫病反復感染、不易控制的主要原因之一。本研究的GoCV檢出率為32.43%，常與MDRV、GAstV、GPV、FAdV、H9等病毒核酸同時檢出，各季節、各日齡段的鵝均易檢出GoCV病毒核酸。雛鵝中GoCV檢出數量較多，可能與垂直傳播有關，應加強對種鵝群GoCV的凈化。

3.3 規?；Z場同時檢出多種病毒核酸的現象需要得到更多的關注

本研究表明，我國部分地區規?；Z場可以持續同時檢測出多種病毒核酸，筆者猜測這或許是規?；Z場病毒性疫病防控復雜化的原因之一。當2種或2種以上病毒同時或先后感染鵝時，會產生協同作用，常會導致臨床癥狀與病理變化復雜化，極易造成誤判與漏判，使鵝群感染率與死亡率升高，造成較為嚴重的經濟損失。因此，除了常規的疫苗防控及藥物治療外，應根據每種病毒性疫病的傳播特點及相互之間的作用規律制定合理的防控計劃，加強引種檢疫與種源凈化，減少垂直傳播。此外，切斷傳播途徑及媒介，對免疫抑制性病原加強監控，定期監測抗體水平，通過多種手段綜合保障規模化鵝場的生物安全。

4 結論

（1）解釋了多種病毒核酸共存的原因，提出了針對生產的意見。

（2）對規?；Z場進行了11種病毒核酸的檢測，觀察到數種病毒核酸同時檢測出的現象（85.89%），以2種（38.26%）或3種（29.17%）病毒核酸同時檢出的情況居多。

（3）規?；Z場中GAstV、DRV、MDRV、GPV、GoCV、FAdV等病毒核酸的檢出率較高，均在30.00%以上。

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Investigation and Analysis of Nucleic Acid Detection Results of Viral Viruses in Large-Scale Goose Farms

SHAO Zhen, DIAO YouXiang

College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai′an 271000, Shandong

【Objective】The author’s research group has long investigated the nucleic acid detection rate of common viral diseases in scaled goose farms in various provinces and cities in China, and found that many large-scaled goose farms in China could detect multiple viral nucleic acids at the same time, and this phenomenon was very common. In view of the lack of relevant data on the simultaneous detection of multiple viral diseases in large-scale goose farms in China, the purpose of this paper was to understand and analyze the simultaneous detection of nucleic acids of multiple viral diseases in large-scaled goose farms, so as to provide the theoretical guidance and scientific basis for the prevention and control of viral diseases in scaled goose farms. 【Method】From May 2021 to October 2021, 737 diseased materials were collected from 47 scaled goose farms in Shandong, Heilongjiang, Sichuan, Jilin, Guangxi, Henan, Anhui, Liaoning, Hebei, Guizhou, Hunan and Inner Mongolia. These samples were detected for Muscovy duck reovirus (MDRV), duck reovirus (DRV), goose astroviruses (GAstV), fowl adenovirus (FAdV), reticuloendotheliosis virus (REV), Newcastle disease (NDV), goose parvovirus (GPV), goose circovirus (GoCV), goose hemorrhagic polyomavirus (GHPV), Tembusu virus (TMUV) and H9 subtype avian influenza virus (H9-AIV) by ordinary PCR and RT-PCR. The liver, spleen, lung and kidney were dissected from each sample, and total RNAs were extracted by Trizol method; a strand of cDNA was synthesized by reverse transcription with total RNA as the template, and then the complete cDNA was obtained by continuous amplification with cDNA as the template. Using these cDNA as template, the specific primers of MDRV, DRV, GAstV, FAdV, REV, NDV, GPV, GoCV, GHPV, TMUV and H9-AIV were used to amplify the target fragment by ordinary PCR reaction. All amplified fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis, and some positive samples were sequenced. The obtained sequencing results were compared with the corresponding virus gene sequences published on GenBank, and the phylogenetic tree was drawn by Neighbor-Joining (N-J) method in MEGA 6.0 software for analysis. 【Result】MDRV, DRV, GAstV, FAdV, REV, NDV, GPV, GoCV, GHPV, TMUV and H9-AIV showed that the detection rate of GAstV was the highest, with the value of 58.21%; the detection rates of REV and NDV were the lowest, with the value of 1.36% and 1.50%, respectively. A variety of viral nucleic acids could be detected simultaneously in geese to varying degrees, especially in two or three viral nucleic acids, accounting for 67.44% of the total samples. In the simultaneous detection rate of nucleic acids of the two viruses, GAstV and GoCV accounted for the largest proportion, which was 18.44%; MDRV, GAstV and GPV accounted for 36.28% of the simultaneous detection rates of the three virus nucleic acids. 【Conclusion】It was further confirmed that multiple viral nucleic acids could be detected simultaneously in large-scaled goose farms in China. It was speculated that this might be one of the important reasons for the complexity of viral diseases and the difficulty of prevention and control in large-scaled goose farms in China.

scaled goose farm; nucleic acid test; phylogenetic analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.016

2022-01-13；

2022-05-23

現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-42-19）

邵震，Tel：15526836071；E-mail：1250101253@qq.com。通信作者刁有祥，Tel：13605386443；E-mail：yxdiao@163.com

（責任編輯 林鑒非）