內蒙古自治區蒙古族聚集區丁型肝炎流行現狀分析

付春山, 馮笑梅, 遲秀梅, 訾 君, 牛俊奇, 張專才

1內蒙古自治區國際蒙醫醫院 a.消化一科,b.檢驗科, 呼和浩特 010013; 2 吉林大學第一醫院感染性疾病及病原生物學中心基因治療實驗室, 長春 130061; 3 吉林大學第一醫院感染性疾病及病原生物學中心肝病科, 長春 130012

1977年意大利學者Rizzetto等[1]首次用免疫熒光法在慢性乙型肝炎患者的肝細胞核內發現一種新的病毒抗原,并稱為δ因子。1984年將該種因子正式命名δ抗原(hepatitis D antigen, HDAg),其病毒分子被命名為丁型肝炎病毒(HDV),所致疾病則被稱為丁型肝炎。同時感染會引起大范圍的肝壞死,以及嚴重的、暴發性的肝炎,病死率較高。大部分同時感染的患者能夠清除兩種病毒,只有少于5%的患者會發展成慢性丁型肝炎(CHD);雙重感染較HBV單感染以及HBV、HDV同時感染,引起更快的硬化過程,肝癌發生率也更高。大多數雙重感染的患者通常無法清除HDV,90%的患者會發展成CHD[2-5]。 隨著對HDV研究的越來越深入,丁型肝炎與乙型肝炎的關系被闡明的較為清楚,近年來也出現了一些丁型肝炎的治療藥物[6-8]。各大公司競相在中國進行丁型肝炎的藥物臨床試驗。內蒙古自治區毗鄰蒙古國,而蒙古國又是世界上丁型肝炎發病率極高的國家。因此,有必要對內蒙古自治區蒙古族聚集區人群的HDV感染情況進行研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2019年4月—2020年10月在內蒙古自治區國際蒙醫醫院就診的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性患者的血清標本,記錄性別、年齡、民族、HBsAg定量等信息。根據患者基本信息將患者分為乙型肝炎合并肝硬化組和乙型肝炎組;根據HBsAg水平將患者分為HBsAg<250 IU/mL組和HBsAg≥250 IU/mL組。收集檢驗剩余血清約1 mL凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 患者入選標準 根據研究方案(JDYY-HDV V3)的規定,從醫院收集相應的標本進行檢測需要滿足以下條件:(1)年齡≥ 18歲,男女不限;(2)既往診斷為慢性HBV感染(即HBsAg陽性≥ 3個月);(3)肝硬化(包括代償期和失代償期肝硬化)。肝硬化的評估標準如下:(1)基于活檢的肝硬化證據,要求Metavir評分為4,或Ishak評分為5～6。(2)若無活檢結果,患者應滿足以下標準之一,①腹水;②肝性腦病;③靜脈曲張破裂出血。以上標準需排除因非肝硬化性門靜脈高壓導致的腹水、肝性腦病或上消化道出血。(3)如果上述標準均未滿足,患者應滿足以下4個標準中的任意兩項,①顯示肝硬化特征的成像圖為肝臟表面不規則,肝實質顆粒或結節狀,腹腔內側支循環或靜脈曲張,伴或不伴脾大(脾厚超過4.0 cm或大于5個肋單元);②PLT <100×109/L;③ALT<5倍正常值上限時,測得肝硬度>12 kPa;④內鏡顯示胃食管靜脈曲張。

1.3 設備與材料 HBsAg檢測采用i2000全自動免疫發光儀(美國雅培公司)。HDV抗體(HDV-IgM、HDV-IgG)采用ELISA法檢測(北京萬泰生物藥業股份有限公司)。全自動核酸提取儀磁珠法進行病毒核酸提取;HDV核酸(HDV RNA)采用實時定量PCR方法,購買RoboGene 2.0 HDV RNA檢測試劑盒(德國RoboScreen診斷試劑公司)。

酶標儀/洗板機(美國ThermoFisher公司),全自動免疫發光儀(美國Abbott公司),核酸提取儀(山東見微),PCR儀(美國BioRad公司),實時定量PCR儀(美國ABI7500)。

1.4 HDV抗體檢測 采用北京萬泰生物HDV-IgM和HDV-IgG試劑盒進行血清樣本中HDV抗體檢測。按照說明書加樣孵育30 min后洗板,加酶標試劑30 min后洗板,顯色15 min后用雙波長450/600 nm檢測吸光度值。

1.5 核酸提取 利用全自動核酸提取儀按照說明書進行HDV病毒核酸提取。購買山東見微預分裝核酸提取試劑Ⅰ套盒,將血清標本200 μL加入試劑盒A2～H2 列或者A8～H8列中,設置好固定運行程序進行核酸提取。核酸提取物體積80 μL備用。

1.6 病毒核酸定量檢測 所有抗體陽性的標本進行HDV RNA檢測。按照RoboGene 2.0 HDV RNA試劑盒說明書進行。根據標準品濃度計算核酸濃度,檢測下限為6 IU/mL。

1.7 基因分型和系統進化樹構建 將核酸檢測陽性的標本進行分型檢測,分型采用PCR方法,采用引物序列為F:5′-CATGCCGACCCGAAGAGGAAAG-3′;R:5′-GAAGGAAGGCCCTCGAGAACAAGA-3′,擴增后進行測序分析。利用BioEdit軟件進行運算和分析,用MEGA 6.0軟件neighbor-joining方法構建系統進化樹進行基因分型。參照序列均從GeneBank下載。

2 結果

2.1 一般資料 共納入230例HBsAg陽性患者,其中乙型肝炎合并肝硬化患者18例,乙型肝炎患者212例;平均年齡(46.5±14.2)歲。

2.2 丁型肝炎抗體檢測 將230份標本進行丁型肝炎抗體檢測,HDV-IgM陽性32例,HDV-IgG陽性37例(16.09%),并且所有IgM陽性的標本都包含在IgG陽性標本中。18份肝硬化的標本中HDV-IgG陽性8份,占肝硬化標本的44.44%。同時又將HBsAg結果進行了分層分析,HBsAg<250 IU/mL組共104份標本,其中僅3份標本HDV-IgG為陽性,陽性率為2.88%(3/104),這3份標本表面抗原定量分別為246、104、23IU/mL。HBsAg≥250IU/mL組共126份標本,其中有34份檢測出HDV-IgG陽性,陽性率為26.98%(34/126)(表1)。 肝硬化組與乙型肝炎組HDV-IgG陽性率比較差異有統計學意義(χ2=16.157,P<0.05);HBsAg<250 IU/mL和HBsAg≥250 IU/mL兩組HDV-IgG陽性率比較差異有統計學意義(χ2=55.082,P<0.05)。

2.3 HDV定量檢測 將HDV-IgG陽性的37份標本提取核酸,并進行HDV RNA定量檢測。其中34份檢測出HDV RNA陽性,總標本HDV RNA陽性率為91.89%(34/37),肝硬化組HDV RNA陽性率為100%(8/8),HBsAg<250 IU/mL組HDV RNA陽性率為33.33%(1/3),而HBsAg≥250 IU/mL組HDV RNA陽性率為97.06%(33/34)(表1)。 HBsAg<250 IU/mL和HBsAg≥250 IU/mL兩組HDV RNA陽性率比較差異有統計學意義(χ2=37.132,P<0.05)。

表1 患者基本信息

2.4 HDV分型檢測及系統進化樹 將HDV RNA陽性的34份標本進行HDV分型測定。其中7例因病毒定量很低而無法獲得分型數據,其余27例均測得分型為1型(圖1)。

圖1 HDV分型系統樹

3 討論

目前常用于HDV檢測的標志物包括:HDAg、HDV-IgM/IgG、HDV RNA?？乖瓩z測在實際應用中意義較小[9-10],抗體檢測應用比較廣泛。HDV感染可以刺激具有免疫能力的患者的固有免疫和適應性免疫,從而產生抗體HDV-IgM和HDV-IgG[6]。HDV-IgM一般在出現HDV感染癥狀后的2～3周后出現。對于同時感染的患者來說,HDV-IgM一般會在急性感染2個月后消失;對于雙重感染的患者來說,HDV-IgM可能會持續存在9個月左右[3]。HDV-IgG存在于已從 HDV急性感染中康復,或發展成HDV慢性感染的患者血漿中[3],故HDV-IgG陽性常代表患者處于康復或慢性感染階段[6]。本試驗中所有HDV-IgM陽性標本均包含在HDV-IgG陽性標本中,而人群的自然感染史并不十分清楚,所以猜測在慢性持續狀態下可能兩種抗體是持續存在的。HDV抗體陽性還需要采用金標準——HDV RNA檢測來進一步確認HDV感染。常用的檢測方法為定量或半定量實時PCR法。RoboGene HDV RNA檢測試劑盒是目前國際公認的檢測效能最高的試劑盒。

丁型肝炎流行的地區性差異比較大,高流行率的地區包括蒙古、亞馬遜流域、中非、中歐和東歐等[11]。很多國家沒有完善的丁型肝炎流行病學的調查,理論上,HBsAg陽性的人群都應檢測HDV抗體,但實際全世界HDV檢測率總體水平不高。英國的檢測率為40%～90%,希臘約為35%,美國約為5%。

Roggenbach等[12]對內蒙古就診的HBsAg陽性患者進行HDV初步篩查,HDV IgG陽性率為13.94%(35/251)。對其中抗體陽性患者進行HDV核酸復測,檢出率為97.14%(34/35), HDV RNA陽性率為13.55%(34/251)。前期在內蒙古收集的標本中有來源于其他漢族人口集中居住區的標本,篩查結果均為陰性。本文描述的都是國際蒙醫醫院就診的蒙古族或蒙古國的患者,其陽性率較其他地區高,提示內蒙古自治區的HDV流行呈現區域化分布。內蒙古自治區接壤的蒙古共和國,是目前已知的HDV流行率最高的地區,HDV RNA在HBsAg陽性患者中的陽性率高達56.91%(70/123)[13-15],內蒙古自治區毗鄰蒙古國,地理位置接近,生活習慣相似,這可能是造成內蒙古自治區流行率較高的原因。因此有必要對內蒙古自治區人群進一步行丁型肝炎發病情況的分析。

本研究發現,總體丁型肝炎抗體陽性率達到16.09%。進一步分層分析顯示,肝硬化患者標本HDV-IgG陽性率高達44.44%,驗證了重疊感染能夠加速病情的發展。電話隨訪1年的結果顯示,有十余人已因肝硬化或肝癌去世,這就更進一步驗證了此結論。而對HBsAg水平進行分層分析發現,HBsAg<250 IU/mL組中僅有3例抗體檢測陽性,其中2例HBsAg定量很接近250 IU/mL。這說明HBsAg定量與丁型肝炎的感染具有相關性。

在對HDV RNA的進一步檢測中發現,整體HDV RNA陽性率較高(91.89%)。肝硬化組HDV RNA陽性率為100%,HBsAg≥250 IU/mL組HDV RNA陽性率為97.06%。說明內蒙古自治區HDV感染情況較為嚴重,HDV RNA檢測率極高。此外,HDV分型檢測結果顯示,內蒙古自治區HDV分型主要為1型。

綜上,內蒙古自治區HDV感染率較高,尤其在肝硬化人群及HBsAg≥250 IU/mL的人群中感染率更高。針對該部分人群應該加大力度進行丁型肝炎的篩查,盡早發現隱藏的丁型肝炎患者,做到早診斷早治療,為早日清除肝病的目標貢獻力量。

倫理學聲明：本研究經由吉林大學第一醫院倫理委員會批準,批號:19K056-001。所有患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：付春山負責患者資料收集,撰寫論文;馮笑梅負責標本收集及論文審閱;遲秀梅、訾君負責標本檢測,資料分析,撰寫論文;張專才、牛俊奇負責課題設計,論文審閱并最后定稿。